胸腔積液中白細(xì)胞對(duì)端粒酶活性影響的分析

楊俊俊 徐興祥 閔凌峰 黃 謙賈冬云 林 平 錢(qián)桂生

端粒酶是迄今發(fā)現(xiàn)的較為廣譜的腫瘤標(biāo)志物之一，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。研究表明，端粒酶活性增高只存在于腫瘤細(xì)胞和少數(shù)正常體細(xì)胞中，如骨髓細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、生殖細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。因此端粒酶活性檢測(cè)現(xiàn)多被用來(lái)鑒別腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞。但用于檢測(cè)胸腔積液中端粒酶活性時(shí)其敏感性和特異性有較大差異［1-3］。另有研究表明受胸腔積液中白細(xì)胞(white blood cells，WBC)，尤其是活化的淋巴細(xì)胞影響，端粒酶活性的檢測(cè)對(duì)于惡性胸腔積液和結(jié)核性胸腔積液的鑒別并無(wú)太大價(jià)值［4］。因此如果將胸腔積液中的WBC去除即可排除活化的淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)的干擾，可能有利于良惡性胸腔積液的鑒別。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用TRAP-PCR-ELISA法檢測(cè)分別經(jīng)免疫磁珠陰性法及密度梯度離心法富集的腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性，旨在比較兩者之間的差異，以明確WBC對(duì)積液中腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的影響。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2010年7月至2011年7月江蘇省蘇北人民醫(yī)院呼吸科15例患者的胸腔積液:包括經(jīng)病理活檢證實(shí)的10例腫瘤患者的胸腔積液標(biāo)本，其中男7例，女3例，年齡40～91歲，平均63．4歲;5例非腫瘤患者的胸腔積液標(biāo)本(結(jié)核性滲出性胸膜炎4例，肺炎旁積液1例)，其中男2例，女3例，年齡25～79歲，平均47．8歲。本研究獲得本院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。嚴(yán)格按照無(wú)菌操作對(duì)患者行胸腔穿刺術(shù)或閉式引流術(shù)，用無(wú)菌離心管取100 ml胸腔積液，盡快送檢并于1 h內(nèi)富集腫瘤細(xì)胞。

二、試劑與儀器

抗CD45標(biāo)記的納米磁珠、CK18-Alexa488單抗、抗CD45-Alexa594、Triton-X 100、細(xì)胞核熒光染料4＇，6-二瞇-2 苯吲哚(4＇，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、PBS 緩沖液、單核細(xì)胞分離緩沖液(CS1、CS2、CS3)及固定液均由美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校(University of California at San Diego，UCSD)林平教授無(wú)償提供，TRAP-PCR-ELISA試劑盒(羅氏公司);條形磁力架(美國(guó)Promega公司)、垂直混懸儀(寧波新芝公司)、電子顯微鏡(日本Nikon公司)、聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)儀(Perkin-Elmer Cetus Gene Amp 9600)，低溫高速離心機(jī)(西安 TG16W)，旋渦混勻儀(美國(guó)SCI Vortex)，PCR冰盒(北京優(yōu)冷 PCR-9604、PCR2404)，超低溫冰箱(丹麥 Heo-Holten 3410)，全自動(dòng)洗板機(jī)(美國(guó)Biotek ELX50/6)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek ELX800UV)，酶聯(lián)反應(yīng)加速儀(北京 M305649)等。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1．胸腔積液中腫瘤細(xì)胞的富集

(1)免疫磁珠陰性法:按文獻(xiàn)［5］中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法并做部分改動(dòng)，取45 ml胸腔積液離心(1900 r/min，室溫，5 min)，棄上清液至5 ml，加CS1緩沖液至45 ml，輕柔顛倒混勻離心(1900 r/min，室溫，5 min)，棄上清液至12 ml并將細(xì)胞沉淀混勻后加CS2紅細(xì)胞裂解液至45 ml，將其置于垂直混勻儀混勻3～7 min，離心(1900 r/min，室溫，5 min)，棄上清至1～2 ml，輕輕混勻后補(bǔ)加CS1至5 ml，按每107個(gè)白細(xì)胞加40 μl磁珠比例加入抗CD45納米磁珠，混勻后置于水平搖床上室溫孵育20 min;后將所有液體輕輕疊加至3 ml CS3頂層，離心(1500 r/min，室溫，5 min)，離心后可見(jiàn)3層溶液，輕柔吸取最上2層溶液移至新的15 ml離心管內(nèi)，加CS1至14 ml，輕柔顛倒混勻后離心(2300 r/min，室溫，5 min)，棄上清至300 μl;加入1 ml CS1，混勻沉淀細(xì)胞，將液體轉(zhuǎn)移至2 ml離心管中，靠在磁力架上2～3 min后將液體轉(zhuǎn)移至1．5 ml離心管中，離心(3400 r/min，室溫，3 min)，去上清至300 μl，取適量細(xì)胞與固定液混合后進(jìn)行涂片，用于CK、CD45及DAPI標(biāo)記的免疫熒光染色進(jìn)行腫瘤細(xì)胞及WBC的鑒定;剩余取2×105細(xì)胞用于端粒酶活性檢測(cè)，若不立即檢測(cè)置于－80℃冰箱中備用。

(2)密度梯度離心法:將15份胸腔積液標(biāo)本(每份標(biāo)本45 ml)同時(shí)用密度梯度離心法富集，用于同免疫磁珠陰性法比較。富集方法參照文獻(xiàn)［6］，離心后取單個(gè)核細(xì)胞層細(xì)胞至新管，PBS洗滌細(xì)胞2次(1300 r/min，室溫，5 min)，棄上清，用1 ml PBS重懸細(xì)胞，用于端粒酶活性檢測(cè)，若不立即檢測(cè)置于－80℃冰箱中備用。

2．免疫熒光染色法檢測(cè)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞及WBC:免疫磁珠陰性法富集后的胸水細(xì)胞涂片經(jīng)PBS緩沖液潤(rùn)洗5 min，0．1%Trion X-100膜通透5 min，PBS洗滌3次，以2%BSA-PBS室溫封閉30 min，加1∶200稀釋的CK18和1∶400稀釋的 CD45熒光抗體，室溫孵育60 min，0．2%BSA-PBS溶液洗滌3次，每次3 min，避光晾干，加5μl DAPI復(fù)染、封片。免疫熒光染色鑒定陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞呈現(xiàn)CK18和DAPI(+)，CD45(－)，且核漿比例較大者判定為腫瘤細(xì)胞。免疫熒光染色鑒定WBC的標(biāo)準(zhǔn)為CD45(+)的細(xì)胞。

3．端粒酶活性檢測(cè):按TRAP-PCR-ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(1)細(xì)胞提取物的制備:將上述兩種方法富集后的細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)(血計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù));移取2×105細(xì)胞于新的離心管，用PBS洗滌細(xì)胞3次，低溫離心(3000 r/min，5 min，4℃);加入200 μl裂解液重懸細(xì)胞，用移液管至少吹打3次，0℃孵化30 min;離心(16 000 r/min，20 min，4℃);小心移取上清至新的離心管，確保沒(méi)有細(xì)胞碎片，一般只移取175 μl細(xì)胞提取物。

(2)PCR擴(kuò)增(TRAP反應(yīng)):取TRAP反應(yīng)管，各加入30 μl反應(yīng)混合物，并加3 μl細(xì)胞提取物，混勻后添加無(wú)RNA酶的蒸餾水至終體積50 μl。陰性對(duì)照添加3 μl熱處理后的細(xì)胞提取物(將細(xì)胞提取物于85℃熱處理10 min)，陽(yáng)性對(duì)照添加1 μl端粒酶質(zhì)控模板溶液，空白對(duì)照添加1 μl裂解液。PCR 循環(huán)擴(kuò)增:25℃ 10 min，94℃ 5 min，然后 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán)，72℃，10 min。

(3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbet assay，ELISA)檢測(cè):每個(gè)樣本分別移取10 μl變性液于兩個(gè)反應(yīng)管中，分別添加2．5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，15～25℃孵育10 min;同一樣本的兩個(gè)反應(yīng)管中，一管加入100 μl雜交緩沖液T，另一管加入100 μl雜交緩沖液IS，分別混勻。(陰性對(duì)照反應(yīng)管加入100 μl雜交緩沖液T)。每個(gè)反應(yīng)管移取100 μl溶液至包被好的微量滴定板，并用鋁箔紙蓋住置于酶聯(lián)反應(yīng)加速儀反應(yīng)1 h;移去微量滴定板中的混合溶液，并用250 μl沖洗緩沖液洗板3次，每次不少于30 s;向每孔中加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗二硝基苯抗體工作液100 μl，15～25℃孵育30 min(振蕩器300 r/min振蕩)，然后洗滌5次;加熱TMB到15～25℃，然后向每孔中加入100 μl預(yù)熱的TMB，15 ～25℃顯色10 ～20min(振蕩器300 r/min 振蕩)，每孔加100 μl終止液終止反應(yīng);加入終止液30 min內(nèi)應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)，測(cè)定各孔波長(zhǎng)450 nm吸光度(A450)、波長(zhǎng)690 nm吸光度(A690)的值，A690為參考波長(zhǎng)，用于消除孔間誤差。

(4)結(jié)果判定:①ΔA=AS-ASO，若ΔA大于兩倍的ASO則判定為端粒酶陽(yáng)性;② 相對(duì)端粒酶活性(relative telomerase activities，RTA)計(jì)算

AS:樣品吸光度

ASO:熱處理后樣品吸光度

AS．IS:IS樣品吸光度

ATS8:對(duì)照模板吸光度

ATS8．0:裂解液吸光度

ATS8．IS:對(duì)照模板的IS吸光度

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件做McNemar’s Test分析及配對(duì)樣本比較的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有顯著性。

結(jié) 果

一、免疫熒光染色鑒定WBC

經(jīng)免疫磁珠陰性法富集后利用免疫熒光染色進(jìn)行WBC的鑒定，其中CD45(+)者為WBC，而在15例胸腔積液富集后的細(xì)胞涂片中均未見(jiàn)明顯的CD45(+)細(xì)胞(如圖1、2)。

圖1 惡性胸腔積液免疫熒光染色下的細(xì)胞涂片①CK-18陽(yáng)性的細(xì)胞(呈綠光);②對(duì)應(yīng)①圖中細(xì)胞的細(xì)胞核(DAPI染色，呈藍(lán)光);③CD45抗體染色細(xì)胞(呈紅光，幾乎無(wú)CD45陽(yáng)性細(xì)胞)

圖2 良性胸腔積液免疫熒光染色下的細(xì)胞涂片①CK-18陽(yáng)性的細(xì)胞(呈綠光);②對(duì)應(yīng)①圖中細(xì)胞的細(xì)胞核(DAPI染色，呈藍(lán)光);③CD45抗體染色細(xì)胞(呈紅光，幾乎無(wú)CD45陽(yáng)性細(xì)胞)

二、定性分析去除WBC前后胸腔積液腫瘤細(xì)胞端粒酶活性

15例胸腔積液經(jīng)免疫磁珠陰性法及密度梯度離心法富集后利用TRAP-PCR-ELISA法檢測(cè)富集細(xì)胞端粒酶活性，利用吸光度差值(ΔA)進(jìn)行定性分析，其中10例惡性胸腔積液利用免疫磁珠陰性法富集后有7例端粒酶活性呈陽(yáng)性表達(dá)，密度梯度離心法富集后有3例表達(dá)陽(yáng)性。經(jīng)McNemar’s Test分析，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(χ2=2．25，P=0．125)。經(jīng)兩種方法富集后5例良性胸腔積液端粒酶活性均為陰性。

三、定量分析去除WBC前后胸腔積液腫瘤細(xì)胞相對(duì)端粒酶活性值

利用RTA進(jìn)行定量分析，其中10例惡性胸腔積液RTA值，見(jiàn)表1;5例良性胸腔積液RTA值，見(jiàn)表2。經(jīng)配對(duì)樣本比較的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，10例惡性胸腔積液經(jīng)兩種方法富集后的RTA值比較有差異(P=0．007)，免疫磁珠陰性法富集后惡性胸腔積液RTA明顯高于密度梯度離心法富集者。5例良性胸腔積液經(jīng)兩種方法富集后的RTA值之間比較無(wú)顯著性差異(P=0．08)。

表1 經(jīng)兩種方法富集后惡性胸腔積液RTA值Table 1 RTA of malignant pleural effusions after enrichment by two methods

表2 經(jīng)兩種方法富集后良性胸腔積液RTA值Table 2 RTA of benign pleural effusions enrichment by two methods

討 論

端粒酶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，是目前發(fā)現(xiàn)的較為廣譜的腫瘤標(biāo)志物之一［7］。大量研究表明:端粒酶活性增高只存在于干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞，以及一些增殖比較活躍的組織和細(xì)胞中，如骨髓、皮膚、胃腸道、睪丸以及活化的淋巴細(xì)胞等。因此可用來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。TRAP法是基于PCR的原理檢測(cè)端粒酶活性的方法，具有較高的敏感性，能在104個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到一個(gè)端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞［8］。許多研究表明，TRAP法檢測(cè)端粒酶活性是用于鑒別積液性質(zhì)的一種有效且無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方法，尤其適用于與傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)相結(jié)合［2-3，9-10］。然而，部分研究顯示端粒酶活性的檢測(cè)對(duì)于惡性胸腔積液的診斷價(jià)值較?。?1-12］，并且由于檢測(cè)方法的不同及胸腔積液中細(xì)胞成分的差異導(dǎo)致端粒酶活性檢測(cè)的敏感性和特異性有較大差異［1-3］。Zendehrokh等［13］的研究顯示應(yīng)用TRAP原位法檢測(cè)胸腹水中端粒酶活性，其中腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及增生的間皮細(xì)胞可呈現(xiàn)核陽(yáng)性，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞可呈現(xiàn)胞漿陽(yáng)性。因此胸腔積液中WBC，尤其是淋巴細(xì)胞的存在可能會(huì)影響端粒酶活性檢測(cè)的敏感性和特異性，良性胸腔積液中大量的淋巴細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致端粒酶活性的假陽(yáng)性，而惡性胸腔積液中如果腫瘤細(xì)胞含量較少還可能會(huì)導(dǎo)致端粒酶活性的假陰性。

本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中建立的免疫磁珠陰性法可以有效去除胸腔積液中的WBC，因此本實(shí)驗(yàn)利用TRAP-PCR-ELISA法檢測(cè)去除WBC前后的胸腔積液中端粒酶活性。免疫磁珠陰性法的原理是利用包被有抗CD45抗體的免疫磁珠與WBC共同抗原CD45特異性結(jié)合，然后在磁場(chǎng)作用下將胸腔積液中白細(xì)胞去除，同時(shí)用紅細(xì)胞裂解液及緩沖液去除胸腔積液中的紅細(xì)胞及蛋白成分，從而提高了腫瘤細(xì)胞的純度，理論上保留了所有的腫瘤細(xì)胞。如結(jié)果中圖1、2所示，免疫磁珠陰性法可有效去除胸腔積液中的WBC。由于免疫磁珠陰性法富集后胸腔積液細(xì)胞數(shù)量明顯減少，最終僅納入15例胸腔積液進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè)，其中10例惡性胸腔積液，5例良性胸腔積液。由于實(shí)驗(yàn)例數(shù)有限，10例惡性胸腔積液經(jīng)兩種方法富集后利用吸光度差值(ΔA)定性比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而利用RTA定量比較進(jìn)行Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，去除白細(xì)胞前后端粒酶活性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且去除WBC后腫瘤細(xì)胞RTA值明顯高于未去除WBC者(P=0．007)。這可能是由于應(yīng)用免疫磁珠法將胸腔積液中WBC去除后腫瘤細(xì)胞得到富集，純度較高，因此端粒酶活性較高的緣故，雖然WBC尤其是活化的淋巴細(xì)胞也會(huì)表達(dá)端粒酶活性，但是其活性較低，104個(gè)淋巴細(xì)胞的端粒酶活性相當(dāng)于同等數(shù)量的永生化細(xì)胞端粒酶活性的0．1%。因此惡性胸腔積液中腫瘤細(xì)胞含量較少時(shí)，大量WBC的存在會(huì)使端粒酶活性檢測(cè)呈現(xiàn)假陰性。本研究中5例良性胸腔積液利用RTA定量比較顯示，去除WBC前后端粒酶活性無(wú)明顯差異(P=0．08)。這說(shuō)明良性胸腔積液中端粒酶活性較低。本研究結(jié)果顯示惡性胸腔積液端粒酶活性定性分析在去除WBC前后無(wú)明顯差異，而定量分析在去除WBC前后有明顯差異。這可能主要是由于實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少，如果增加樣本量，不難預(yù)測(cè)在去除WBC后惡性胸腔積液端粒酶活性陽(yáng)性率將明顯高于未去除WBC。去除WBC后胸腔積液端粒酶活性檢測(cè)的敏感性和特異性可能會(huì)明顯增高，更加有利于良惡性胸腔積液的鑒別。既往的研究證實(shí)良性胸腔積液中大量活化淋巴細(xì)胞的存在會(huì)導(dǎo)致端粒酶活性檢測(cè)的假陽(yáng)性，在本研究中也證實(shí)惡性胸腔積液中大量WBC的存在可能會(huì)在一定程度上“抑制”腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的表達(dá)，導(dǎo)致端粒酶活性檢測(cè)的假陰性。因此WBC對(duì)胸腔積液端粒酶活性的影響是雙重的，應(yīng)用免疫磁珠陰性法去除WBC后可以減少甚至消除WBC對(duì)端粒酶活性的影響，并且有利于良惡性胸腔積液的鑒別診斷，尤其是對(duì)于腫瘤細(xì)胞含量較少的惡性胸腔積液。

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