E-cadherin蛋白表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預后的聯系

閔凌峰 徐興祥 陳 勇 楊俊俊黃 謙 賈冬云 宋 勇

E-cadherin蛋白是一種鈣依賴性的黏附分子，主要介導上皮細胞間的黏附和維持組織結構的完整性，在維持細胞形態、遷移及黏附功能上具有重要作用［1］。E-cadherin蛋白常在多種腫瘤中失活，其表達減弱或缺失可促進腫瘤細胞的轉移［2-3］。吸煙是影響肺癌患者存活率的獨立有害因素，其負面影響是獨立于吸煙相關并發癥的［4］。吸煙對NSCLC患者不良預后的影響，可能是通過與調節肺癌細胞的生物學行為相關，如轉移能力等［5］。因此，本研究通過回顧性分析探討E-cadherin蛋白與非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者臨床病理特征及預后的關系，側重探討吸煙嚴重程度對E-cadherin蛋白表達的影響，為抑制肺癌轉移研究提供新的實驗基礎和理論依據。

材料和方法

一、研究對象

112例具有隨訪資料的原發性肺鱗癌、腺癌組織標本來自2003年10月到2005年10月未經放療和化療的初診患者，并經病理診斷確診。其中男90例，女22例，平均年齡為58歲。按2004年WHO肺腫瘤組織學分類標準，其中鱗癌70例，腺癌42例。高分化7例，高中分化15例，中分化47例，中低分化23例，低分化20例。患者的吸煙嚴重程度-吸煙年包(吸煙年包=每日吸煙包數×吸煙年)分為0、戒煙組、1－19、20－39、40－59、＞60六組。依據國際抗癌聯盟(UICC)1999年修訂的肺癌p-TNM分期標準，Ⅰ期9例，Ⅱ期20例，Ⅲ期75例，Ⅳ期8例。患者生存期的計算是從初診日期到隨訪日期，或由于復發、轉移而死亡的日期為止。

二、主要試劑

E-cadherin鼠抗人單克隆抗體購于Santa cruz公司，免疫組織化學超敏S-P試劑盒及DAB辣根過氧化酶酶底物顯色劑購于福州邁新生物技術開發公司。

三、免疫組化染色

以3μm厚度連續切片，經松節油脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS沖洗三次后，按試劑盒說明進行RKIP染色。DAB染色，蘇木素復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

四、結果判定標準

E-cadherin陽性染色定位于細胞膜。光鏡高倍鏡下，隨機選擇5個視野，分別計算200個細胞，共計算1000個細胞，采用雙評分法，參照Consantine等的標準，高倍鏡(×400)下綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。染色強度評分標準:不著色0分;黃色1分;棕黃色2分;黃褐色3分。陽性細胞所占比例評分標準:陽性細胞數＜10% 者0分;10% ～40% 者1分;40% ～70% 者2分;≥70% 者3分。兩種評分相加，0～1分為(－);2分為(+);3～4分為(++);5～6分為(+++)［6］。

五、統計學分析

應用SPSS18．0統計軟件對實驗結果進行統計學分析，組間多重比較采用Kruskal-Wallis test，兩兩比較用Mann Whitney U test，P＜0．05即差異有統計學意義。應用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，應用Cox比例風險模型進行多因素分析，P＜0．05即差異有統計學意義。

結 果

一、NSCLC臨床病理特征與吸煙狀況的關系

吸煙狀況與患者的肺癌病理類型(腺癌或鱗癌)、腫瘤原發灶狀況(T-status)、遠處轉移狀況(M-status)、TNM分期等均無明顯關系(P＞0．05)，差異無統計學意義。但吸煙的狀況與患者的性別(P＜0．01)、年齡(P＜0．05)、區域淋巴結轉移狀況(N-status)(P＜0．05)、腫瘤分化程度(P＜0．05)明顯相關，差異有統計學意義，見表1。

表1 112例NSCLC患者臨床病理特征與吸煙狀況關系Table 1 Relationship between clinicopathologic features and smoking status of 112 NSCLC patients

二、免疫組織化學檢測E-cadherin在NSCLC中的表達

采用免疫組織化學檢測E-cadherin蛋白在42例腺癌、70例鱗癌組織中的表達水平。結果顯示E-cadherin蛋白主要定位在細胞膜，在腺癌及鱗癌組織中均有表達，但吸煙者肺腺癌及鱗癌組織中表達較不吸煙者明顯下降(圖1)。統計學分析(Kruskal-Wallis秩和檢驗)顯示E-cadherin表達與性別、年齡、肺癌病理類型、腫瘤原發灶狀況(T-status)、遠處轉移狀況(M-status)及腫瘤分化程度等均無明顯關系(P＞0．05)，但與患者的區域淋巴結轉移狀況(N-status)、TNM分期及吸煙狀況明顯相關(P＜0．05)，見表2。

表2 E-cadherin蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系Table 2 Relationship between expression of E-cadherin protein and clinicopathologic features of NSCLC patients

圖1 免疫組織化學檢測E-cadherin在NSCLC組織中的表達A:非吸煙肺腺癌;B:吸煙肺腺癌;C:非吸煙肺鱗癌;D:吸煙肺鱗癌

三、多變量分析有意義的預后因子及生存曲線分析

多變量分析結果顯示:腫瘤原發灶狀況(T-status)、遠處轉移狀況(M-status)、TNM分期、腫瘤分化程度、吸煙嚴重程度、E-cadherin的表達是獨立的 NSCLC預后因子(P＜0．05)，見表3。Kaplan-Meie生存曲線分析結果顯示:E-cadherin表達下調的患者，其生存率明顯下降(P＜0．05，圖2)。

表3 多變量分析有意義的預后因子Table 3 Significant prognostic factor of multivariated analysis

圖2 Kaplan-Meier生存曲線

討 論

鈣黏蛋白(cadherin)是一組 Ca2+依賴性跨膜糖蛋白，主要有E、P、N三種亞型，目前認為E-cadherin與腫瘤浸潤和轉移的關系較密切［7］。E-cadherin是維持上皮細胞形態及同種細胞間黏附連接的重要黏附分子。相關研究已證實E-cadherin基因是一個重要的腫瘤轉移抑制基因，它可能通過促進同型細胞之間的黏附，使癌細胞之間保持密切接觸，減少癌細胞脫離原發灶向遠處轉移［8］。如果E-cadherin表達下降，腫瘤細胞連接松散，也可使腫瘤細胞分裂增殖失控，易脫離原發灶而發生局部或遠處轉移［9］。

E-cadherin與肺癌關系的眾多研究發現，肺癌細胞E-cadherin表達缺失或降低以及功能缺陷與肺癌的侵襲和轉移可能存在相關性［10］。本研究結果顯示E-cadherin表達與性別、年齡、肺癌病理類型、腫瘤原發灶狀況(T-status)、腫瘤分化程度等均無明顯關系(P＞0．05)。但E-cadherin的表達與患者的區域淋巴結轉移狀況(N-status)、TNM分期及吸煙狀況明顯相關(P＜0．05)。E-cadherin的表達下降是上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程的重要標志物。EMT是腫瘤細胞侵襲轉移的重要機制，可以影響腫瘤患者預后［11］。EMT過程有著一系列特征性的改變:①形態學方面的改變，細胞由上皮細胞表型向間質細胞表型轉變，梭形細胞、偽足增加;②細胞功能方面的改變，細胞轉移侵襲能力增強;③分子生物學方面的改變，間質細胞標志蛋白N-鈣黏蛋白(N-cadherin)，波形蛋白(vimentin)表達升高，而上皮細胞標志蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達下降［12］。體內研究表明通過RNAi介導的E-cadherin下調足以誘導EMT，促使腫瘤細胞轉移［13］。另外，本研究發現E-cadherin下降與患者的遠處轉移狀況(M-status)無明顯相關，這與Sorscher等［14］在33例原發和遠處轉移性NSCLC標本中應用免疫組化法檢測E-cadherin表達的研究結果類似。這也說明與E-cadherin的表達相關的是淋巴結轉移，而非遠處轉移，其具體的分子機制尚待進一步研究。

尤其值得注意的是，本研究發現E-cadherin的表達下降與吸煙嚴重程度明顯相關。吸煙過程可產生4000多種化學物質，大約200種是有致癌性的，包括多環芳烴類化合物(PAH)及尼古丁等。其中采用香煙煙霧中重要致癌物B［a］P處理A549細胞后，E-cadherin表達下降，A549細胞出現EMT樣改變。B［a］P啟動和促進肺癌轉移可能是通過促進Twist表達升高，然后，通過與E-cadherin促進子區E-boxes作用而下調E-cadherin表達，進而在EMT、腫瘤進展和轉移起重要作用［15］。香煙煙霧中另外一種致癌物尼古丁也通過煙堿乙酰膽堿受體(a7-nAChRs)促進A549細胞轉移，且有時間和劑量依賴性［16］。由此可見，E-cadherin表達下降可能是吸煙導致肺癌患者出現淋巴結轉移的重要原因。

腫瘤引起的致死原因中90%是因為惡性腫瘤的轉移［17］。以前的觀點認為轉移是癌癥進展中的一個晚期事件，即在原發腫瘤細胞積累了一系列的基因變異之后才啟動了癌癥基因。然而，Podsypanina等［18］的實驗結果提示，腫瘤的轉移可能發生于疾病早期。吸煙的肺癌患者預后差，可能同香煙煙霧中的致癌物導致肺癌早期轉移有很大關系。已經存在肺癌的前期病變或早期腫瘤的吸煙患者，如果仍在吸煙的情況下可能更易出現轉移［19］。本研究的生存分析結果也表明E-cadherin表達下調的患者生存率明顯下降。有研究應用酶聯免疫法檢測79例肺癌患者中E-cadherin血清水平，結果發現E-cadherin表達缺失與肺癌的進展相關，且E-cadherin診斷的特異性為90%，鱗癌、SCLC和腺癌的敏感性分別為66．6%、47．6%及43．7%［20］。這提示E-cadherin可作為檢測肺癌轉移與預后的一種標志物。

綜上所述，在NSCLC中檢測E-cadherin的表達，對判斷腫瘤的淋巴結轉移趨勢、及判斷患者預后有重要意義。E-cadherin表達下降可能是吸煙導致肺癌患者出現淋巴結轉移的重要原因。

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