NTHi肺炎小鼠肺2型與3型脫碘酶m RNA的變化

天津市兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科（天津300074） 商躍云 黃 樂 孫桂香 呂 玲 趙 彥

NTHi肺炎小鼠肺2型與3型脫碘酶m RNA的變化

天津市兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科（天津300074） 商躍云 黃 樂 孫桂香 呂 玲 趙 彥

目的：探討不可分型流感嗜血桿菌（NTHi）肺炎小鼠血三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、促甲狀腺素（TSH）及肺2型脫碘酶（D2）與3型脫碘酶（D3）m RNA水平的變化，推測(cè)肺炎并正常甲狀腺病態(tài)綜合征（ESS）的發(fā)生機(jī)制，為其治療提供理論依據(jù)。方法：C57BL／6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、感染3d組、感染7d組與感染10d組。對(duì)照組取血及肺組織，感染組于制備小鼠NTHi肺炎模型后3、7及10d取血及肺組織，放射免疫分析法檢測(cè)血清T3、T4及TSH水平，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real－time PCR）法測(cè)定肺D2及D3m RNA水平。數(shù)據(jù)以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：四組T3、TSH、D2及D3m RNA相對(duì)表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，T4的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。感染后3d T3與TSH水平低于對(duì)照組，后逐漸回升，于感染后10d其水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與之相對(duì)應(yīng)，感染后3d D3水平高于對(duì)照組，感染后7d D2水平方始高于對(duì)照組，后逐漸回落，于感染后10d仍均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：NTHi肺炎可并發(fā)ESS，D2與D3m RNA水平的變化與其發(fā)生有關(guān)。

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）分為莢膜型和無莢膜型，前者根據(jù)莢膜多糖的血清型又分為六種亞型；后者因不能與Hi莢膜多糖抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)，稱為不可分型流感嗜血桿菌（Nontypeable ha－ernophilus influenzae，NTHi）。無論發(fā)達(dá)或發(fā)展中國家，NTHi相關(guān)呼吸道感染仍是兒童呼吸系統(tǒng)疾病的主要原因，主要引起肺炎、會(huì)厭炎和中耳炎等［1］。嚴(yán)重的呼吸道感染多伴有正常甲狀腺病態(tài)綜合征［2］（Eu－thyroid sick syndromes，ESS），即甲狀腺功能異常，且能排除原發(fā)性甲狀腺疾病所致改變的一組綜合征，其主要表現(xiàn)為血清三碘甲狀腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）水平降低并伴有反三碘甲狀腺原氨酸（Reverse triiodothyronine，r T3）升高。其發(fā)生機(jī)制尚未完全明了，推測(cè)與脫碘酶的改變有關(guān)。脫碘酶催化甲狀腺激素（Thyroid hormone，TH）在體內(nèi)的脫碘代謝，是調(diào)節(jié)TH內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要因素。脫碘酶共有3種類型，即1型脫碘酶（Type 1 iodothyronine deiodinase，D1）、2 型脫碘酶（Type 2 iodothyronine deiodinase，D2）與3型脫碘酶（Type 3 iodothyronine deiodinase，D3），其中，D1與D2催化外周組織中的甲狀腺素（Thyroxine，T4）轉(zhuǎn)化為T3，即甲狀腺激素原的活化，而D3的主要作用是清除血清T3和產(chǎn)生r T3，即TH的滅活［3］。本研究旨在通過C57BL／6小鼠NTHi肺炎肺脫碘酶m RNA的變化推測(cè)肺炎并發(fā)ESS的發(fā)生機(jī)制，為肺炎并ESS的治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器：二氧化碳孵箱：Thermo－Forma SeriesⅡ Water Jackcted CO2Incubator，Thermo Electron Corporation，F(xiàn)inland；紫外分光光度計(jì)：Smart Spec TM plus spectrophotometer，Bio－Rad，USA；電泳儀：Power Pac Basic，Bio－Rad，USA；凝膠成像系統(tǒng)：Chemi Doc XRS，Bio－Rad USA；Realtime PCR儀7500型：Applied Biosystems，USA。

1.2 主要試劑：T3、T4及TSH試劑盒：天津九鼎醫(yī) 學(xué) 生 物 公 司 （批 號(hào)：160445）；Trizol：Invitrogen Technoloyies Ins，USA（批號(hào)：1158824）；DEPC：天津鼎天生物技術(shù)有限公司，Sigma分裝進(jìn)口（批號(hào)：D5758）；乙二胺四乙酸（EDTA）：Sigma公司（批號(hào)：083K5420）；d NTP：Fermentas（批號(hào)：9001）；Taq酶：Fermentas（批號(hào)：1005）；Oligo d（T）18：大連寶生物工程有限公司（批號(hào)：CT201C）；Ribonuclease inhibitor：大連寶生物工程有限公司（批號(hào)：CCA3901A）；DL2000 DNA Marker：大連寶生物工程有限公司（批號(hào)：CC1502）；逆轉(zhuǎn)錄酶 M－MLV：Promega（批號(hào)：19847105）；引物合成：北京奧科生物工程公司；Fast－Start Universal SYBR Green Master（Rox）：Roche，Germany（批號(hào)：04 913 914 001）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 NTHi瓊脂珠懸液的制備：將－70℃脫脂牛奶凍存菌株（ATCC 49247，肺炎患者痰標(biāo)本中分離）劃線接種于哥倫比亞巧克力平板，37℃5%CO2培養(yǎng)24～48h，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種平板，分離出單個(gè)菌落。挑取平板4～5個(gè)典型菌落種入sBHI肉湯中，懸搖狀態(tài)下培養(yǎng)18～24h，離心收集細(xì)菌，感染緩沖液重懸，倍比稀釋，分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，繪制細(xì)菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。從新鮮平板挑取菌落，接種于1 000ml sBHI液體培養(yǎng)基中，于37℃懸搖狀態(tài)下培養(yǎng)18～24h。離心收集細(xì)菌，于2×感染緩沖液中重懸，濃縮菌液，調(diào)整至細(xì)菌濃度2×109～6×109菌落形成單位（Colony－forming unit，CFU）／ml。

細(xì)菌濃縮液加熱至45℃，取濃縮菌液2ml與45℃溶化的瓊脂等量混合，45℃水浴中徹底混勻。5ml注射器吸取混合物3ml迅速注入27ml 4℃快速攪拌著的1×感染緩沖液中，形成由瓊脂包裹細(xì)菌的NTHi瓊脂珠懸液。懸浮液包含細(xì)菌濃度為1×108CFU／ml的不定形瓊脂珠。吸取30μl于0.lml注射器中，37℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 C57BL／6小鼠NTHi肺炎模型的建立與分組：取5～6周SPF級(jí)雌性C57BL／6小鼠32只，體重15～20g（購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院），隨機(jī)分為對(duì)照組、感染3d組、感染7d組與感染10d組，每組8只，乙醚麻醉小鼠，對(duì)照組鼻腔吸入30μl空白瓊脂珠，感染組鼻腔吸入30μl 1×108CFU／ml的NTHi瓊脂珠，誘發(fā)肺部炎癥，在吸入后3、7及10d取血并處死，取肺組織備用。

2.3 T3、T4、TSH及D2D3mRNA水平的測(cè)定：血清T3、T4及TSH水平的定量測(cè)定采用放射免疫分析法。D2及D3mRNA水平的定量測(cè)定采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real time polymerase chain reaction，Realtime PCR）法，主要操作步驟如下：采用Trizol法分別提取肺組織總RNA，紫外分光光度法對(duì)其定量，吸光度260／280比值判定純度，瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測(cè)完整性。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。內(nèi)參照肌動(dòng)蛋白（β－actin）與目的片段D2及D3的引物應(yīng)用軟件Gene Runner、并根據(jù)Gen Bank所發(fā)布的目的基因序列自行設(shè)計(jì)，同時(shí)經(jīng)NCBI BLAST檢索無顯著同源性。具體引物序列和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，見表1。

表1 Real－time PCR 引物序列

Real－time PCR反應(yīng)體系參照SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒說明書。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸34s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溫度變化速度為3℃／s，在每個(gè)循環(huán)延伸階段檢測(cè)熒光信號(hào)，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，最后進(jìn)入解鏈階段，繪制產(chǎn)物的融解曲線，以了解樣品擴(kuò)增的特異性，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。數(shù)據(jù)的收集由ABI 7500定量PCR儀自帶軟件完成。每管樣品重復(fù)測(cè)定4次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步比較采用Dunnet檢驗(yàn)。

結(jié) 果

T3、T4、TSH及D2D3m RNA水平比較：四組T3、TSH、D2及D3m RNA相對(duì)表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝47.129、9.028、16.600、10.505，P＜0.01），T4的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.467，P＞0.05）。感染后3d T3與TSH水平低于對(duì)照組，后逐漸回升，于感染后10d其水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與之相對(duì)應(yīng)，感染后3d D3水平高于對(duì)照組，感染后7d D2水平方始高于對(duì)照組，后逐漸回落，于感染后10d其水平仍均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見附表。

附表 T3、T4、TSH及D2 D3 m RNA水平比較（±s，n＝8）

附表 T3、T4、TSH及D2 D3 m RNA水平比較（±s，n＝8）

注：與對(duì)照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

m RNA對(duì)照組 1.04±0.10 116.38±22.32 3.23±0.21 1.00±0.00 1.00±0.00組別 T3（μg／L） T4（μg／L） TSH（Iu／L） D2 m RNA D3 3d 0.60±0.10＊＊ 112.46±24.49 2.89±0.10＊＊ 1.01±0.11 1.59±0.34＊＊7d 0.62±0.09＊＊ 112.10±28.16 2.91±0.23＊ 1.31±0.13＊＊ 1.77±0.45＊＊10d 0.93±0.06 102.23±24.50 3.29±0.23 1.30±0.18＊＊ 1.93±0.43＊＊

討 論

NTHi是兒童肺炎的常見病原之一，嚴(yán)重感染者可并發(fā)ESS。本研究證實(shí)NTHi肺炎小鼠血清T3與TSH水平降低，T4水平改變不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以往的相關(guān)研究推測(cè)其發(fā)生機(jī)制與脫碘酶的活性改變有關(guān)［4］，但尚未驗(yàn)證此推斷，且并未涉及脫碘酶量的改變。本研究證實(shí)感染后D3m RNA水平首先明顯升高，TH的滅活增加，即T3水平首先迅速降低；隨后D2mRNA水平升高，D3m RNA水平逐漸回落，感染后10d仍未至對(duì)照組水平，與之相對(duì)應(yīng)的是TH的活化逐漸回升，即T3水平逐漸回升。

NTHi是常見的人體共生菌，多定植于鼻咽部。共生的平衡狀態(tài)取決于宿主、微環(huán)境和微生物之間相互作用。一旦宿主、微環(huán)境和微生物之間平衡被打破，NTHi就從相對(duì)無害的共生菌變成致病菌，通過NTHi的粘附作用、誘導(dǎo)促炎因子釋放、逃避宿主防御等致病。NTHi粘附于粘膜和細(xì)胞外基質(zhì)的能力是其在特定宿主定植的前提；釋放的游離脂寡糖是單核細(xì)胞釋放炎癥因子的強(qiáng)激活劑，介導(dǎo)細(xì)胞熱休克蛋白表達(dá)、增加肺泡巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子－α的生成，使中性粒細(xì)胞迅速聚集引起宿主炎癥反應(yīng)，對(duì)肺部造成直接和間接損傷；同時(shí)NTHi通過多種機(jī)制來逃避宿主的防御，與機(jī)體處于共生狀態(tài)，例如NTHi可產(chǎn)生三類Ig A蛋白酶，均從鉸鏈區(qū)斷裂Ig A重鏈［5］。

ESS的產(chǎn)生與早產(chǎn)、營養(yǎng)因素、各種損傷、心力衰竭、呼吸衰竭、營養(yǎng)不良以及腫瘤等有關(guān)，另外，外科手術(shù)后、糖尿病、結(jié)締組織疾病等亦可致ESS［6］。

在急性炎癥的動(dòng)物模型中，D2活性上調(diào)，進(jìn)一步研究證實(shí)，炎癥所致的D2活性上調(diào)是通過c AMP途徑的激活調(diào)節(jié)的［7］。

出生后絕大多數(shù)正常組織中D3m RNA的表達(dá)水平很低，但在多種疾病所致ESS D3m RNA表達(dá)重新被激活，從而降低T3水平，此現(xiàn)象提示了D3m RNA表達(dá)水平與ESS的相關(guān)性。D3mRNA的表達(dá)水平受多種因素調(diào)控，能被促紅細(xì)胞生成素、表皮生長(zhǎng)因子、酸性或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素6等炎性因子誘導(dǎo)而增加其轉(zhuǎn)錄水平［8］。有研究證實(shí)急性細(xì)菌感染的小鼠模型中，被感染器官的中性粒細(xì)胞D3活性升高，T3水平顯著減少；感染的野生型小鼠與D3基因敲除的小鼠白細(xì)胞介素6與腫瘤壞死因子－α均升高，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；然而，與野生型小鼠相比，D3基因敲除的小鼠細(xì)菌數(shù)明顯升高［9］。

D3m RNA表達(dá)水平于感染后迅速明顯升高，可致感染后TH的滅活迅速增加，T3水平降低，從而降低代謝率與耗氧量，這一現(xiàn)象支持傳統(tǒng)上認(rèn)為的ESS時(shí)T3水平降低有利于能量平衡與減輕損傷。因此，有些學(xué)者認(rèn)為，ESS的治療就是對(duì)原發(fā)疾病的治療，TH替代治療對(duì)ESS病人是不需要的，人為給予TH治療，提高血清TH水平到正常范圍并不能改善ESS病人的預(yù)后，相反，人為地增加機(jī)體代謝，促使機(jī)體負(fù)氮平衡，增加心臟負(fù)荷，反而會(huì)使原發(fā)疾病惡化［10］。近年發(fā)現(xiàn)T3降低的非甲狀腺疾病中都發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞核T3受體的增多，即可能是機(jī)體組織受損的后果，故也有學(xué)者認(rèn)為適時(shí)、適量、短期應(yīng)用TH替代治療可改善癥狀，減少并發(fā)癥的發(fā)生，促進(jìn)病情的恢復(fù)［11］。根據(jù)本研究結(jié)果，由于感染后D3m RNA水平升高，即TH滅活增加，對(duì)于NTHi肺炎并發(fā)的ESS TH替代治療是否對(duì)局部TH水平有影響尚有待商榷，是否可改善預(yù)后尚有待進(jìn)一步的研究及長(zhǎng)期隨訪。

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Changes of type 2 and type 3 iodothyronine deiodinase mRNA in lungs of mice of NTHi pneumonia

Department of Endocrinology of Tianjin Children’s Hospital（Tianjin 300074）Shang Yueyun Huang Le Sun Guixiang et al

Objective：To explore the changes of T3，T4and TSH levels in serum and type 2 iodothyronine deiodinase（D2）and type 3 iodothyronine deiodinase（D3）m RNA levels in lungs of mice of nontypeable haernophilus influenza（NTHi）pneumonia，to speculate on mechanisms of pneumonia and euthyroid sick syndromes（ESS）and to provide theoretical basis to the treatment.Methods：C57BL／6 mice were randomly divided into control group，3 days after infection group，7 days after infection group and 10 days after infection group.Blood samples and lungs were taken 3，7 and 10 days after establishment of NTHi pneumonia model，T3，T4and TSH levels in serum were detected by radioimmunoassay method and D2and D3m RNA levels in lungs were measured by real time polymerase chain reaction（Real－time PCR）.The data were statistically analyzed by SPSS13.0 software package.Results：There were statistical differences of T3、TSH、D2and D3m RNA levels among the 4 groups（F＝47.129、9.028、16.600、10.505，while there was no statistical difference of T4levels among the 4 groups（F＝0.467）.T3and TSH levels of 3 days after infection group were lower than control group，and then picked up gradually，there was no statistical differences between 10 days after infection group and control group；correspondingly，D3level of 3 days after infection group was higher than control group and D2level of 7 days after infection group was higher than control group and then gradually dropped，but both were still higher than control group 10 days after infection，the differences were statistically significant.Conclusion：ESS may occur as complication of NTHi pneumonia and changes of D2and D3m RNA profiles involve in it.

Haemophilus influenzae／enzymology Pneumonia／immunology ＠Type 2 iodothyronine deiodinase ＠Type 3 iodothyronine deiodinase ＠Euthyroid sick syndromes Mice

流感嗜血菌／酶學(xué) 肺炎／免疫學(xué) ＠2型脫碘酶 ＠3型脫碘酶 ＠非甲狀腺疾病病態(tài)綜合征 小鼠

R392.3

A

1000－7377（2012）03－0272－04

（收稿：2011－07－15）