熒光原位雜交技術在膀胱癌診斷中的臨床應用▲

覃智標 蒙清貴 畢革文 文亦磊 黃瑞旭

(1廣西中醫藥大學第一附屬醫院泌尿外科，南寧市 530023;2廣西醫科大學附屬腫瘤醫院泌尿外科，南寧市 530021;3廣西中醫藥大學第一附屬醫院病理科，南寧市 530023)

熒光原位雜交技術在膀胱癌診斷中的臨床應用▲

覃智標1蒙清貴2畢革文1文亦磊3黃瑞旭1

(1廣西中醫藥大學第一附屬醫院泌尿外科，南寧市 530023;2廣西醫科大學附屬腫瘤醫院泌尿外科，南寧市 530021;3廣西中醫藥大學第一附屬醫院病理科，南寧市 530023)

目的探討熒光原位雜交技術(FISH)在膀胱癌診斷中的臨床應用價值。方法對30例可疑膀胱尿路移行上皮細胞腫瘤的血尿患者的尿液標本同時行尿脫落細胞學檢測和熒光原位雜交分析，并與最終的病理學檢查結果對比。結果尿脫落細胞學的靈敏度為33.33%，特異度為100%，FISH的靈敏度為85.71%，特異度為 88.89%，兩者靈敏度相比差異具有統計學意義(P＜0.05)，而兩者特異度相比差異無統計學意義(P＞0.05)。結論FISH技術在檢測膀胱移行上皮細胞癌方面具有較高的靈敏度和特異度，在膀胱癌的診斷中具有重要的臨床意義和實用價值。

熒光原位雜交;膀胱癌;細胞學;診斷

膀胱癌是泌尿系統最常見的腫瘤，在我國男性泌尿生殖系統腫瘤中，其發病率和死亡率均占首位。早期發現和診斷膀胱癌對于患者的治療和預后意義重大。為避免傳統的侵入性檢查方法如膀胱鏡檢等給患者帶來的痛苦和尿道損傷、泌尿系感染等風險，以及針對尿脫落細胞學敏感度較底的不足，我們將熒光原位雜交技術(FISH)技術用以診斷膀胱癌，并與尿脫落細胞學檢查結果相比較，評估FISH技術在膀胱尿路上皮癌診斷中的臨床應用價值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 2010年1月至2012年1月收集廣西中醫藥大學第一附屬醫院30例住院患者的尿液標本，納入的標準為經影像學和實驗室檢查除外泌尿系結石及腎、輸尿管、前列腺病變和泌尿系感染等引起的血尿者。其中男性18例，女性12例，年齡24～80歲，平均(50±12)歲。

1.2 儀器和試劑 熒光原位雜交操作平臺:OLYMPUS BX51系統顯微鏡，OLYMPUS BX-UCB通道轉換系統，X-cite SERIES120熒光燈，DELL微型計算機，Prog Res Capture Pro 2.5 攝像系統，VIDEOTEST-FISH 2.0 圖像分析處理系統;上海躍進SHHW 21420三用恒溫水浴箱和上海博迅HPX-9052 MBE恒溫培養箱，Seven Milti型 pH/電導率/離子綜合測試儀和常熟雙杰T 200型電子天平，長沙湘智TXZ5-WS臺式離心機。實驗中應用的 FISH試劑購自北京金菩嘉醫療科技有限公司，為GLPP 16/CSP 17(紅色/綠色)和CSP 7/CSP 3(紅色/綠色)兩組。

1.3 實驗方法 患者均在膀胱鏡檢查前行尿脫落細胞FISH檢測和細胞學檢查。連續3 d留取晨尿200 mL，1 h內送檢。采用一次性使用的清潔干燥容器，注意避免標本污染。每份尿樣分為2份，分別行尿脫落細胞學檢查和FISH檢測，并將其檢測結果與最終的病理檢查結果對比。

1.3.1 FISH 檢測方法

1.3.1.1 標本配制 新鮮尿液標本離心后去上清液，依次加入膠原酶B 2 mL、KCl低滲溶液5 mL、甲醇固定液2 mL后離心去除上清液;加固定液5 mL，室溫靜置5 min，再次離心去上清液;加固定液5 mL重復固定1次;離心后去除上清液后滴片;室溫下過夜老化玻片。

1.3.1.2 標本處理 用 Rnase(Sigma，0.1 g/L)和 Pepsin(Sigma，0.1 g/L)先后處理，多聚甲醛固定 15 min。PBS緩沖液洗滌后，玻片加700 ml/L甲酰胺/2xSSC(pH 7.0)溶液，72℃變性3 min，2xSSC －4℃ 3 min洗滌2次，梯度乙醇脫水，室溫晾干。

1.3.1.3 雜交 將探針加到玻片的標本上覆蓋玻片，Rubber Cement封片后置濕盒37℃溫箱中避光雜交48 h。

1.3.1.4 洗片 除去蓋玻片，將玻片放入500 ml/L甲酰胺/2xSSC溶液，42℃洗滌 15 min。2xSSC室溫搖洗3 min×2次，梯度乙醇脫水，室溫暗處晾干，加2 mL二氨基苯基吲哚(DAPI，Vysis公司)復染，封片。送熒光顯微鏡下觀察，CCD攝取圖像并進行圖形分析統計。

1.3.1.5 結果判定 本研究的陽性結果判斷完全依據金菩嘉公司提供的標準進行。分為紅色(GLPP 16和CSP 7探針)和綠色(CSP 17和CSP 3探針)兩種信號。4個探針中有2種或者2種以上的探針異常信號出現就可以判定為陽性結果。

1.3.2 尿脫落細胞學檢查 將受檢患者的尿液標本離心后取脫落細胞制成病理涂片，用顯微鏡進行觀察。每例患者連續留取3 d尿液標本做脫落細胞學檢查，發現1次癌細胞即可判定為陽性結果。

1.4 統計學方法 用 SPSS 13.0軟件進行分析統計，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

以膀胱鏡和術后病理檢查結果作為診斷的金標準，該30例患者通過膀胱鏡活檢或手術后病理檢查明確診斷為膀胱移行上皮細胞癌患者21例，膀胱良性病變9例。尿脫落細胞學的靈敏度為33.33%，特異度為100%;FISH的靈敏度為85.71%，特異度為88.89%，兩者靈敏度相比差異具有統計學意義(P＜0.05)，而兩者特異度相比差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 兩種檢測方法靈敏度及特異度比較

3 討論

目前，膀胱癌的診斷、檢測主要以膀胱鏡檢查組織活檢和尿脫落細胞學檢查為主。前者較直觀且準確性高，但對于肉眼難辨的微小扁平腫瘤發現困難，易造成漏診［1］，且為有創性檢查，可能損傷尿道引起尿道狹窄，甚至造成假道，同時也增加了逆行尿路感染的風險，部分患者很難接受膀胱鏡檢所帶來的痛苦;后者特異性高，但對低級別腫瘤的診斷敏感性較低。目前文獻報道的尿脫落細胞學檢測膀胱癌的敏感度為13% ～75%，特異度為85% ～100%［2］。因此，如何能夠以一種無創、快速的方法對膀胱癌進行檢測，同時又能夠具有較高的敏感性和特異性，成為目前臨床上亟待解決的問題。

FISH是一種應用熒光物質依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體中顯示DNA(或RNA)序列位置的方法。根據堿基互補配對的原則，利用已知的熒光素標記的單鏈DNA(或RNA)與待檢材料中未知的單鏈DNA(或RNA)進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。FISH具有安全、快速、靈敏度高、檢測信號強、雜交特異性高、能同時顯示多種顏色等優點，不僅能顯示細胞中期分裂相，還能顯示間期核［3］。作為一種新興的檢測技術，FISH廣泛應用于血液腫瘤、實體腫瘤的診斷與檢測。目前研究已證實3號、7號、9(p16)號、17號染色體的遺傳學改變與膀胱癌的早期發生及發展、復發密切相關［4］。而本組研究所采用的FISH探針則是針對以上四種染色體的。

目前國內不少報道已指出，FISH在診斷膀胱尿路上皮癌方面較尿細胞脫落學檢查具有更高的敏感性，而特異性相似［5～7］。本組研究結果顯示，尿脫落細胞學的靈敏度為33.33%、特異度為100%，FISH的靈敏度為85.71%、特異度為 88.89%，兩者靈敏度相比差異具有統計學意義(P＜0.05)，而兩者特異度相比差異無統計學意義(P＞0.05)，與目前的研究報道結果相似。可見，FISH在診斷及檢測膀胱癌方面同時具有較高的敏感度和特異度，且該方法簡便、迅速、安全，可以很好地彌補膀胱鏡檢及尿脫落細胞學檢查的不足之處。

FISH檢測方法安全、快速，靈敏度及特異度均較高，且探針可長時間保存，可多色標記，結果觀察簡單直觀，除用于脫落細胞檢測外，還可廣泛運用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標本等多種物質的檢測。該方法在各系統實體腫瘤及血液腫瘤的診斷及監測中均可采用，具有重要的臨床實際運用價值。

［1］ Schmidbauer J，Witjes F，Schmeller N，et al.Improved detection of urothelial carcinoma in situ with hexaminolevulinate fluorescence cystoscopy［J］.J Urol，2004，171(1):135 －138.

［2］ Van Rhijn BW，van der Poel HG，van der Kwast TH.Urine markers for bladder cancer surveillance:a systematic review［J］.Eur Urol，2005，47(6):736 －748.

［3］ Stephens JL，Brown SE，Lapitan NL，et al.Physical mapping of barley genes using an ultrasensitive fluorescence in situ hybridization technique［J］.Genome，2004，47(1):179 －189.

［4］ Phillips JL，Richardson IC.Aneuploidy in bladder cancers:the utility of fluorescent in situ hybridization in clinical practice［J］.BJU Int，2006，98(1):33 －37.

［5］ 姚 昊，韓 永，蔡 明，等.熒光原位雜交技術診斷膀胱尿路上皮癌臨床研究［J］.中華實用診斷與治療雜志，2011，25(6):535－538.

［6］ 陳瑞廷，楊錦建，賈占奎，等.熒光原位雜交技術在膀胱癌診斷中的應用［J］.鄭州大學學報(醫學版)，2011，46(3):460 －462.

［7］ 曹會彥，劉智明，乜國雁，等.熒光原位雜交技術在膀胱癌診斷中的臨床應用［J］.中國老年學雜志，2011，31(15):2809 －2811.

R 737.14

B

1673-6575(2012)06-0605-03

廣西中醫藥大學重點科研課題(項目編號:2D2009004)

覃智標(1968～)，男，本科，副主任醫師，研究方向:FISH技術在膀胱癌的診斷應用。

2012-08-11

2012-10-27)