VEGF在早期自然流產患者血清及絨毛組織中的表達及臨床意義▲

韋舟玲 龐麗紅 楊冬梅 黎歐陽 石 凌

(1廣西醫科大學，南寧市 530021;2廣西醫科大學第一附屬醫院婦產科，南寧市530021)

VEGF在早期自然流產患者血清及絨毛組織中的表達及臨床意義▲

韋舟玲1龐麗紅2*楊冬梅2黎歐陽2石 凌2

(1廣西醫科大學，南寧市 530021;2廣西醫科大學第一附屬醫院婦產科，南寧市530021)

目的觀察孕早期自然流產患者血管內皮生長因子(VEGF)在血清及絨毛組織中的表達水平，探討VEGF與妊娠關系。方法選擇孕早期自然流產患者25例為觀察組，正常早期妊娠婦女25例為對照組，應用ELISA法檢測血清VEGF含量，采用免疫組織化學方法測定各組孕婦絨毛組織VEGF的表達。結果正常早孕組與孕早期胚胎停育患者血清及絨毛VEGF表達比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。結論VEGF表達異常與復發性流產具有相關性，其表達水平升高可能是導致孕早期胚胎停育的原因之一。

血管內皮生長因子;自然流產;酶聯免疫吸附測定;免疫組織化學

近年來的研究表明，復發性流產的發生與胎盤組織中血管增生平衡和胎兒血液供應不足有密切關系，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最主要的促進血管形成的血管形成增生調節因子，在保持蛻膜組織中血管密度、有效血流量和維持胎兒營養供應上起重要作用。成功的妊娠依賴于胎盤良好的發育和生長，在胎盤植入和胎盤形成的過程中，血管的生成對于成功妊娠是非常關鍵的。雖然對于胎盤血管生成的調控因素還不清楚，但人們已認識到胎盤血管的發育是由多種生長因子及其受體調節完成，這些因子的不正常表達可能導致胎盤血運障礙，在胎盤形成過程中血管功能不全是導致自然流產等產科并發癥的重要因素［1］。

國內外一些學者認為，VEGF升高導致流產發生［2］，VEGF表達水平降低可能也與流產的發生有關［3］。本研究采用酶聯免疫吸附法和免疫組織化學測定自然流產胚胎停育時患者的外周血清及絨毛組織中VEGF表達情況，探討VEGF水平及表達在胚胎停育中可能產生的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年9月至2011年11月在我院門診就診的25例胚胎剛停育的自然流產患者作為觀察對象，患者年齡25～36歲，均排除解剖、遺傳、感染等因素，孕8周前曾B超檢查提示胚胎發育良好，可見原始心管搏動，孕8～12周，經臨床病史、體征、B超、尿人絨毛膜促性腺激素(hCG)檢測確定已經發生難免流產者。選取同期在我院計生門診要求進行人工流產的健康早孕婦女25例為對照組，年齡25～36歲，孕8～12周，年齡、孕周與自然流產組相比差異無統計學意義，并均符合以下要求:①本次妊娠以前有過正常妊娠和分娩史，無死胎、死產、自然流產史;②本次妊娠期間無先兆流產癥狀和體征;③B超提示胚胎發育正常;④無服藥及病毒感染史，無其他內科疾病。

1.2 外周血VEGF水平的檢測 標本采集取自自然流產25例孕婦早晨空腹時肘靜脈血 2 mL，靜止 1 h后，2000 r/min離心15 min，取血清置于－70℃冰箱保存待測;取對照組孕婦肘靜脈血，同法處理。應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定已分離保存的血清中VEGF濃度。操作按試劑盒(購自美國R＆D System公司)的說明書進行。所有標本均設3個復孔且為同批測定，均值為最終濃度，批內變異＜5%，由專人檢測。

1.3 免疫組化法檢測絨毛組織VEGF蛋白水平

1.3.1 絨毛的采集與保存 將手術后采集的絨毛組織用0.9%生理鹽水沖洗后立即置于4%的甲醛液中固定24～48 h，常規石蠟包埋后制成4～5 μm厚的組織切片。

1.3.2 試劑及方法 采用免疫組化二步法染色，觀察絨毛組織中 VEGF的分布及表達。一抗為鼠抗人 VEGF及sFlt-1單克隆抗體工作液，即用型Envisio TM試劑盒，DAB均購自北京中衫生物技術有限公司。染色步驟參照說明書進行。用已知的陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。切片集中染色，以免批內、批間誤差。

1.3.3 結果判定 采用雙盲法觀察陽性反應。VEGF表達陽性信號為棕黃色，位于胞漿，每張切片隨機觀察10個視野，按陽性細胞占總細胞的百分比分為4級，陰性(－):陽性細胞數＜5%;陽性(+):陽性細胞數5% ～25%;中度陽性(++):陽性細胞數25% ～50%;強陽性(+++):陽性細胞數＞50%。

1.4 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料用±s表示，采用t檢驗;計數資料用率表示，采用χ2檢驗或秩和檢驗進行統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 自然流產組和對照組孕婦外周血中 VEGF檢測 ELISA法測定兩組孕婦外周血清中VEGF水平，顯示資料符合正態分布，結果見表1。自然流產組外周血中VEGF 的水平為(2 037.20±1 125.09)ng/L，遠高于對照組外周血中 VEGF 的水平［(882.67 ±595.47)ng/L］。兩者間差異有統計學意義(P＜0.01)。

表1 外周血VEGF水平比較 (±s)

表1 外周血VEGF水平比較 (±s)

注:自然流產胚胎停育組與正常健康早孕組比較，P＜0.01。

組別 n 外周血VEGF水平(ng/L)自然流產胚胎停育組25 2 037.20 ±1 125.09正常健康早孕組25 882.67 ±5955.47

2.2 自然流產胚胎停育及正常早孕絨毛組織VEGF蛋白表達 自然流產胎停育組絨毛組織VEGF蛋白表達水平較正常早孕組高，陽性細胞大于50%的率也較正常健康早孕組高，差異均有統計學意義(P＜0.05)。詳見表2、圖1及圖2。

表2 兩組絨毛上皮組織合體滋養細胞VEGF表達

圖1 RSA組絨毛VEGF的免疫組化(蘇木素復染×400)

圖2 正常早孕組絨毛VEGF的免疫組化(蘇木素復染×400)

3 討論

早期自然流產是產科常見的病理性妊娠之一，病因復雜，發病機制仍不明確。VEGF作為一種主要的血管內皮細胞促血管生長因子，具有使微靜脈、小靜脈通透性增加，促進血管內皮細胞分裂、增殖和細胞漿中鈣離子聚集等作用。Krussel等［4］研究證實VEGF在人類胚胎種植前的胚胎上的表達對于著床過程中的血管形成是必需的;他們用逆轉錄PCR方法檢測了在IVF過程中獲得的19個人類囊胚期胚胎，發現VEGF mRNA在89%的胚胎上表達。

葉喜陽等［2］研究發現，反復自然流產(RSA)患者的血清及絨毛中VEGF水平較正常早孕者升高，與我們研究的結果相符。Nagamatsu等［5］認為，妊娠早期胚胎是在一個相對缺氧的環境中發育的，其后隨著滋養層細胞的不斷侵入，胎盤供氧改善，母胎物質交換得以完善，在缺氧條件下sFlt-mRN表達明顯升高。病理妊娠時，滋養層細胞浸潤表淺與螺旋動脈重鑄不良的直接后果是子宮胎盤血流灌注不足和缺血、缺氧，這對滋養層細胞乃至整個胎盤的功能產生重要影響，并與子癇前期等妊娠疾病的病理機制有關［6，7］。體內和體外由低氧誘導因子所誘導的低氧環境使VEGF mRNA出現高表達。

本研究顯示，自然流產胚胎停育患者血清及絨毛組織中VEGF的表達水平均高于正常妊娠組，差異有統計學意義(P＜0.001)。自然流產胎停育患者較正常早孕絨毛組織VEGF蛋白表達水平高，提示胚胎停育的發生可能與患者血清VEGF和妊娠絨毛組織中VEGF表達水平增高有關。Neufeld等［8］研究推測，低氧VEGFR表達增加的機制可能為:HIF-1與其在VEGF啟動子上的結合位點結合，介導了低氧誘導的VEGF mRNA的轉錄，致使VEGF產生增加。

本研究表明VEGF表達異常與復發性流產具有相關性，其表達水平升高可能是導致孕早期胚胎停育的原因之一。但VEGF對自然流產的作用機制尚未完全闡明，對VEGF進行深入研究，為自然流產患者提供臨床防治依據是我們今后的努力方向。

［1］ Torry DS，Hinrich SM，Torry RJ.Departments of placental vascularity［J］.Am J Reprod Immunol，2004，51(4):257 －268.

［2］ 葉喜陽，徐宏星，徐洪斌.反復自然流產血清及絨毛組織中NO含量和NOS活性及血清中 VEGF含量［J］.中國婦幼保健，2004，14(8):19 －21.

［3］ 鄭 穎，左常婷，劉愛蘭，等.VEGF在復發性流產患者絨毛及蛻膜中的表達［J］.中國婦幼保健，2009，24(6):276 －278.

［4］ Krussel JB，Behr B，Milki AA，et al.Vascular endothelial growth factor mRNA splice variants are differentially expressed in human blastocysts［J］.Mol Hum Reprod，2001，7(1):57 －63.

［5］ Nagamatsu T，Fujii T，Kusumi M，et al.Cytotrophoblasts up-regulate soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression under reduced oxygen:an implication for the placental vascular development and the pathophysiology of preeclampsia［J］.Endocrinology，2004，145(11):4 838－4845.

［6］ Redman CW，Sargent IL.Latest advances in understanding preeclampsia［J］.Science，2005，308(28):592 － 594.

［7］ Merviel P，Carvillon L，Challier JC，et al.Pathophysiology of preeclampsia:links with implantation disorders［J］.European J Obstet Gynecol Reprod Biol，2004，15(2):34 －47.

［8］ Neufeld G，Cohen T，Gengrinovitch S，et al.VEGF and its receptors［J］.FASEB J，l999，l3(1):9 －22.

Expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor in the serum and chorionic villi in patients of early spontaneous abortion

WEI Zhou-ling，PANG Li-hong ，Li Ou-yang(Department of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

ObjectiveTo observe the expression level of vascular endothelial growth factor(VEGF)in the serum and chorionic villus of embryo growth arrest patients，and to explore the relationship between VEGF and early spontaneous abortion.MethodsIn 25 cases of early spontaneous abortion and 25 cases of normal early pregnancy groups，the level of VEGF in serum was measured by enzyme － linked immunosorbent assay and expression of chorionic villus tissue was detected by immunohistochemistry.ResultsThe level of VEGF expressions in both serum and chorionic villus tissue were increased in embryo growth arrest patients compared to those in controls(P ＜0.01).ConclusionThere are relationship between the abnormal expression of VEGF and early spontaneous abortion.The high expression of VEGF may be involved in the pathogenesis of embryo growth arrest.

Vascular endothelial growth factor;Spontaneous abortion;Enzyme-linked immunosorbent assay;Immunohistochemistry

R 714.21

A

1673-6575(2012)06-0582-03

國家自然科學基金(81060053);廣西2011年研究生教育創新計劃資助項目(2011105981002M212);廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科攻11217004)

韋舟玲(1986～)，女，碩士研究生，研究方向 :母親胎兒醫學。

*通訊作者

2012-07-28

2012-09-27)