兒童口腔內變形鏈球菌、乳酸桿菌的檢出情況分析

黃雅靜，黃銳，錢英子，周智*

(1.重慶市口腔疾病與生物醫學研究中心，重慶401147;2.重慶醫科大學口腔醫學院，重慶401147)

齲病是兒童最常見的一種口腔疾病，兒童齲病的發生可導致乳牙疼痛、早失甚至恒牙的萌出，嚴重影響兒童口腔健康、生理發育及心理健康。生態菌斑學提出牙菌斑的組成細菌是口腔內的正常菌群，正常狀態下，各細菌之間以及細菌與宿主之間處于平衡狀態，一旦口腔內環境發生改變，如頻繁攝入碳水化合物或唾液流量減少等可使牙菌斑長期處于低pH值環境，有利于變形鏈球菌、乳酸桿菌等耐酸菌的過度生長，而血鏈球菌、口腔鏈球菌等生長受到抑制，各種細菌間的比例改變，微生態平衡失調，這種情況下脫礦大于再礦化，導致齲病的發生。以往有多項研究表明乳酸桿菌(Lactobacilli，LB)及變形鏈球菌(Streptococcus mutans，MS)具有密切相關性，是兒童齲齒最主要的致齲菌［1］。生態菌斑學說是解釋關于齲病病因學的重要假說，其基本思想是:環境因素的改變可以引起口腔內微生態平衡的破壞，即導致定植于口腔中正常的菌群組成及比例失調，從而引發齲病的發生。變形鏈球菌(MS)和乳酸桿菌(LB)是口腔中的常駐菌，屬口腔常駐細菌，對于口腔菌斑微生態平衡起著重要作用，變形鏈球菌是口腔內公認的主要致齲菌［2］，但是乳酸桿菌多年來一直是學者們爭議的話題，且關于齲病發生中乳酸桿菌與變形鏈球菌的相互關系，不同的研究所得出的結論也不盡一致。本研究擬定量分析不同齲敏感情況下兒童口腔檢出情況，探討二者相關性，揭示其臨床意義，以期為開展微生態學防齲提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料ROGOSA培養基，MSB培養基，微量生化反應試劑。

1.1.2 病例選擇年齡＜12歲的受試者共164人，納入標準［3］:①受試者要求無明顯的牙周病癥狀;②未做過窩溝封閉;③無牙齒結構異常;④未戴牙齒矯治器者;⑤檢查前1 h內未進食;⑥1個月內未服用過抗生素，半年內未服用過激素和免疫抑制劑，1個月內無口腔局部用藥及漱口水;⑦全身無重大系統疾病的患者。符合納入標準的受試者共100人，根據齲敏感程度［3］分為無齲組(DMFS=0)50人，高齲組(DMFS≥6)50人;變異鏈球菌采用MSB培養基，乳酸桿菌采用Rogasa培養基。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集及處理采樣均由同一個檢查者完成:①唾液樣本的采集，收集患兒非刺激性全唾液1 mL于滅菌干燥后的離心管內;②菌斑樣本的采集:唾液取樣后無菌生理鹽水漱口3次，去除口內的食物殘渣，消毒棉球隔濕。采集部位:無齲組取光滑面、窩溝的集合牙菌斑，并分別放入滅菌干燥后含硫乙醇酸鈉溶液的容器內;高齲組取光滑面及窩溝，深層齲壞牙本質的集合牙菌斑，并分別放入含硫乙醇酸鈉溶液的容器內。送往實驗室，經旋渦混勻儀振蕩1 min，用滅菌林格氏液及硫乙醇酸鈉分別10倍系列稀釋唾液和菌斑，2 h內完成接種。

1.2.2 細菌初代培養取唾液及菌斑原濃度、10-1、10-2、10-3稀釋液各20 μL，分別接種于MSBA以及ROGOSA培養平板，80%N2、10%H2、10%CO2，37℃培養48 h，進行菌落檢測和鏡檢細菌形態學鑒定。菌落檢測及細菌形態學鑒定:肉眼觀察可見MSB平板上典型變形鏈球菌菌落為粗糙型，高凸，深藍色嵌頓于瓊脂內，質硬，邊緣不整齊，表面呈玻璃樣。經革蘭染色，油鏡(10×100)下可見變形鏈球菌菌落為G+小球菌，呈長鏈狀或短鏈狀，成隊或分散排列。在Rogosa培養基上乳酸桿菌菌落為白色或灰白色，表面光滑，軟而突起，直徑針尖大小到2 mm左右。經革蘭染色，顯微鏡下見乳酸桿菌為G+桿菌，長桿狀、短桿狀或棒狀，菌落呈圓丘狀，不透明，干酪樣白色，單個、成對或成串排列。

1.2.3 細菌生化反應收集部分變形鏈球菌菌落用微量生化板法進行甘露醇、山梨醇、棉子糖、蜜二糖、七葉苷以及精氨酸的生化鑒定;收集部分乳酸桿菌菌落用微量生化板法進行葡萄糖、乳糖、蔗糖、硝酸及H2O2生化鑒定。

1.2.4 細菌次代純化培養將甘油保種的變形鏈球菌臨床分離株分別接種于MSB培養平板內;甘油保種的乳酸桿菌臨床分離株分別接種于Rogosa培養平板內，培養條件同細菌初代培養。根據菌落形態挑取變形鏈球菌屬及乳酸桿菌屬單菌落，每個實驗對象隨機挑取3～9個顯示不同形態的菌落，劃線轉種于TSA平板進行次代培養，80%N2、10%H2、10%CO2，37℃培養48 h，獲得純培養后做進一步鑒定。將鑒定結果為陽性者，分別置于50%甘油BHI和Rogosa液體保種、備用。1.2.5統計分析采用SPSS 17.0軟件分析實驗結果，細菌檢出率的比較用卡方檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05表示有顯著差異。

2 結果與分析

根據選擇培養基培養結果、菌落形態、細菌形態以及生化鑒定結果，高齲、無齲兒童各主要致齲菌的檢出情況見表1。由表1可見，高齲組變形鏈球菌(88%)和乳酸桿菌(76%)的檢出率均高于無齲組相應細菌(26%、28%)的檢出率，差異有統計學意義(P＜0.05)。由表2可見，納入標準的高齲組受試者50人中有38例患者檢出乳酸桿菌，其中于齲壞深層檢出例數為38例，光滑面、窩溝、唾液檢出例數依次為20、24、20例;檢出變形鏈球菌的病例數為44例，其中于齲壞深層檢出例數為23例，光滑面、窩溝，唾液檢出例數依次為42、34、39例;納入標準的無齲組受試者50人中檢出乳酸桿菌病例數為14例，窩溝、光滑面檢出病例數均為12例，唾液均檢出10例，檢出變形鏈球菌病例數為13例，光滑面檢出病例數為11例，窩溝、唾液依次檢出13、10例。根據x2檢驗分析得齲壞乳酸桿菌檢出率與窩溝、光滑面乳酸桿菌檢出率差異具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 不同部位乳酸桿菌、變形鏈球菌檢出情況Table 1 Detection Lactobacilli and Streptococcus mutans in different sites

表2 不同齲敏感組間乳酸桿菌、變形鏈球菌檢出情況Table 2 Detection Lactobacilli and Streptococcus mutans between different DMFS groups

對各組細菌檢出情況進行統計學分析，顯示高齲組變形鏈球菌、乳酸桿菌的檢出率與無齲組比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，且齲敏感度DMFS與細菌的檢出率有關。

3 討論

MSB是一種分離變形鏈球菌最佳的選擇性培養基，能夠抑制遠緣鏈球菌的生長，變形鏈球菌在該瓊脂培養基上能夠形成較有鑒別意義的菌落形態［4］;Rogosa培養基是乳酸桿菌選擇培養基，因其具有較低的pH值(5.0左右)，對乳酸桿菌具有較強選擇性，除乳酸桿菌外，其他口腔細菌不能生長［5］。

乳酸桿菌屬細菌是一群專性或兼性厭氧菌，口腔流行病學中將乳酸桿菌視為“齲標志菌”，通過對乳酸桿菌的檢測，從而預測齲病的進展趨勢。乳酸桿菌的致齲性主要表現在產酸性和耐酸性。細菌發酵碳水化合物產酸，是使牙體組織脫礦的直接原因。各種動物實驗已經證實了細菌的產酸性與其致齲性密切相關。乳酸桿菌并不是齲病開始的必須條件，但是其對齲損的發展卻起著重要的作用，主要是因為乳酸桿菌能夠發酵糖類，產生有機酸，從而使牙體表面pH降低，導致釉質脫礦，如不及時采取防齲修復措施，則會進一步導致齲損的發生。

本研究結果顯示:高齲組中乳酸桿菌和變形鏈球菌的檢出率明顯高于無齲組(P＜0.05)，且乳酸桿菌、變形鏈球菌的檢出率與齲敏感度DMFS有相關性。此外乳酸桿菌在齲損牙本質深層的檢出率高于光滑面、窩溝處菌斑及唾液乳酸桿菌檢出率(P＜0.05)，說明高齲人群口腔內環境由于乳酸桿菌的存在使pH降至更低，更適合乳酸桿菌和變形鏈球菌等耐酸致齲菌的黏附、增殖，從而大量產酸，進一步抑制其他不耐酸的致齲菌，此外齲損內為微生物提供了保護并形成新的滯留區域。同時損害部位提供齲損崩解物或滯留物，pH值更低，有利于乳酸桿菌的增殖;而齲損深層變形鏈球菌的檢出率卻低于其在光滑面及窩溝處的檢出率，由于齲壞深層環境pH低于變形鏈球菌的適宜生存環境(最適宜pH為7.2)，不利于變形鏈球菌的生存，且乳酸桿菌具有一定的抑菌特性，對變形鏈球菌也具有一定的抑制特性，因此出現齲壞深層變形鏈球菌的檢出率低于其他部位。

以往關于唾液、菌斑中乳酸桿菌、變形鏈球菌的檢出情況與齲壞程度相關性研究，不同研究者就微生物檢出情況與齲病的流行性給出的研究結果不甚一致［6］。有研究［7-9］認為齲損指數與微生物的檢出情況具有緊密相關性，尤其在形成釉質齲損后，更為顯著。本實驗結果也證實乳酸桿菌可預測齲進展情況;而另有一些研究［6，10］卻不能說明齲敏感指數與微生物檢出情況的相關性。本研究結果也證明了DMFS與乳酸桿菌、變形鏈球菌檢出情況的相關性。

鑒于本實驗研究目前所取的實驗樣本例數尚少，實驗結果可能存在一定的偏倚性，故尚需加大試驗樣本量。此外本研究亦有不足之處:如未涉及有齲人群中細菌的分離情況，以及未對分離菌的產酸情況進行檢測，故將進一步追加對有齲人群進行乳酸桿菌、變形鏈球菌的分離及分離菌產酸情況的檢測。

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