思茅松毛蟲腸道產脂肪酶菌株的篩選鑒定及酶學性質初步研究

孫佑赫，周開艷，熊智

(西南林業大學林學院，云南昆明650224)

昆蟲腸道內寄居著大量的細菌，正常的腸道細菌是昆蟲寄主生長發育、繁殖所必須的。近年來隨著胃腸道微生態理論研究的逐步深入，對昆蟲腸道菌群結構和產酶菌株的研究，已成為新的研究熱點。目前，對白蟻、家蠶［1-3］等腸道菌群的研究報道較多，同時亦發現各類產酶菌株的存在，并對酶學性質進行了研究［4-5］。脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)是一類在油水界面催化天然底物油脂(甘油三脂)降解為甘油和游離脂肪酸的酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中［6］。微生物脂肪酶比動植物脂肪酶作用的溫度和pH范圍寬，易獲得較高純度酶制劑，適合于工業上大規模生產［7］。以往，研究者多從土壤、淤泥中采集樣品篩選產酶微生物，本實驗以思茅地區嚴重危害各類松樹的思茅松毛蟲為實驗材料，分離其腸道內產脂肪酶菌株。通過純培養和16S rDNA序列分析，對產酶菌株進行初步鑒定和酶學性質研究，為開發新的具有應用價值的資源微生物增加新的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基①分離培養基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂18，pH 7.0～7.2;②脂肪酶篩選培養基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨10，橄欖油10，瓊脂15，pH 7.0～7.2;③種子培養基(g/L):同分離培養基，不加瓊脂;④產酶發酵培養基［8-9］(g/L):牛肉膏5，蛋白胨5，橄欖油10，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，(NH4)2SO41，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要試劑和儀器DNA提取試劑盒(天根公司)、2×Power Taq PCR MasterMix(BIOTEKE公司)、通用引物(TaKaRa公司)，其余試劑均為分析純;PCR儀(Biometra公司，TGRADIENT)，高速離心機(Eppendorf公司)、凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司，Gel-Doc XR+);電泳儀、滅菌鍋、超凈工作臺、搖床、培養箱、紫外分光光度計等均為國產儀器。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選采自云南普洱的思茅松毛蟲幼蟲，無菌水飼養24 h，排盡其腸道殘余食物。無菌條件下解剖蟲體取其腸道，研磨后，梯度稀釋法涂布于分離培養基，37℃培養48 h。挑取表征形態各異的單菌落劃線純化，鏡檢至純菌株后，使用點接法接種到篩選培養基，37℃培養48 h。然后觀察記錄篩選培養基中能產生透明圈的菌株。將初篩菌株接種于種子培養基，37℃、180 r/min搖床培養過夜。種子液以2%的接種量接種于產酶液體發酵培養基，相同條件下培養48 h。發酵液經10 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液測酶活。

1.2.2 酶活力測定及酶學性質研究采用經典的聚乙烯醇橄欖油乳化液法［10-11］測酶活，每分鐘催化脂肪水解產生1 μmol脂肪酸所需的酶量為1個酶活力單位(U/mL)。相對酶活力是指實驗中所測得的酶活力值與最高酶活力值的百分比。酶的最適溫度:分別測定不同反應溫度下(25、30、35、40、45、50℃)酶活力，確定最適溫度。酶的最適pH:PBS緩沖液調節底物pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在最適溫度下測酶活力，以確定最適pH值。

1.2.3 產酶菌株的分子生物學鑒定細菌DNA試劑盒提取產酶菌株基因組DNA，作為反應模板進行PCR基因擴增。體系:2×Power Taq PCR MasterMix 25 μL，通用引物(正向引物27f:5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，反向引物1492r:5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3')各2 μL，DNA模板1 μL，無菌水補足50 μL;條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，56℃復性1 min，72℃延伸3 min，30個循環;72℃最終延伸5 min。取50 μL PCR擴增產物，送華大基因公司測序。得到測序結果后登陸NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在GenBank數據庫中進行BLAST比對分析［12］，尋找最相似的已知分類地位的序列。使用MEGA4.1軟件的Neighbor-Joining法［13］構建系統發育樹(bootstrap重復次數為1 000)，以確定菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 產脂肪酶菌株的篩選

從思茅松毛蟲幼蟲腸道內篩選出7株產脂肪酶菌株(D2、D7、D9、D12、D16、D17、D19)，部分水解透明圈如圖1所示。

圖1 產脂肪酶菌株在篩選培養基上形成的透明圈Fig.1 Transparent hydrolysis circle by lipase-producing strains

2.2 產酶菌株酶學性質分析

2.2.1 酶最適作用溫度各產酶菌株在不同的反應溫度下測得的酶活力值如圖2所示:這7株產酶菌所產脂肪酶的最適溫度在30～40℃之間。D9、D16的最適溫度是30℃，D7、D17的最適溫度是35℃，D2、D12、D19的最適溫度為40℃。其中D9和D16酶促反應的熱穩定性稍差，在最適溫度附近變化幅度大，相對酶活力達60%左右。

圖2 溫度對脂肪酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of lipase

2.2.2 酶最適作用pH在最適溫度和不同pH條件下各產酶菌株的酶活力如圖3所示:產酶菌株的最適pH集中在8.0～9.0之間，為堿性脂肪酶，在pH 8.0～10.0的范圍內相對酶活力都比較高，達到80%以上，說明pH穩定性都比較好。

圖3 pH對脂肪酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of lipase

2.3 產酶菌株的鑒定結果

提取產酶菌株的基因組DNA并進行16S rDNA PCR擴增，通過BLAST比對分析，選取同源性在98%以上的序列構建系統發育樹(圖4)。由系統發育樹可知7株產酶菌株分屬3個屬:D2、D12、D19屬于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，D7、D17屬于芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)，D9、D16屬于克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)。

圖4 產酶菌株的16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA gene sequence of lipase-producing strains

3 討論

本實驗從思茅松毛蟲幼蟲腸道內分離篩選出7株產脂肪酶的菌株，經過對所產脂肪酶酶學性質的初步研究，確定這些酶作用的最適溫度是30～40℃，最適pH是8.0～9.0，屬于中溫堿性脂肪酶，這與鱗翅目昆蟲堿性(pH 8.0～10.0)腸道環境相關聯。通過研究產酶菌株的產酶溫度和pH，發現產酶菌株的酶活力與已報道的高產酶菌株酶活力［14］還有一定的差距，有待于進一步的實驗研究，優化產酶條件或誘變育種等手段，提高產酶能力和酶活性。

對產酶菌株的16S rDNA基因序列測定和比對后，構建系統發育樹，初步將這7株產酶菌株歸屬為假單胞菌屬、芽胞桿菌屬和克雷伯氏菌。這些種屬細菌在天牛、家蠶、白蟻、蝗蟲［15］等昆蟲的腸道菌群中都有存在，此外常見的昆蟲腸道細菌還有葡萄球菌屬、鏈球菌屬、微球菌屬、腸桿菌屬、乳桿菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙雷氏菌屬等。

目前發現能產脂肪酶和用于工業生產的細菌有28個屬，主要有伯克霍爾德氏菌、無色桿菌屬、芽胞桿菌屬、色桿菌屬、產堿菌屬、節桿菌屬和假單胞菌屬［16］。本實驗篩選出的產脂肪酶細菌除包括2種常見的菌屬外，還有一種克雷伯氏菌，從該屬中分離到產脂肪酶菌株的研究很少見報道［17］。本實驗中發現克雷伯氏菌產脂肪酶性質在開發新穎的資源微生物方面具有積極的研究意義。

［1］ Thongaram T，Hongoh Y，Kosono S，et al.Comparison of bacterial communities in the alkaline gut segment among various species of higher termites［J］.Extremophile，2005，9(3):229-238.

［2］ 袁志輝，藍希鉗，楊廷，等.家蠶腸道細菌群體調查與分析［J］.微生物學報，2006，46(2):285-291.

［3］ Lehman R M，Lundgren J G，Petzke L M.Bacterial communities associated with the digestive tract of the predatory ground beetle，Poecilus chalcites，and their modification by laboratory rearing and antibiotic treatment［J］.Microbial Ecology，2009，57(2):349-358.

［4］ 鄒昌瑞，魏國清，劉朝良，等.柞蠶腸道菌群分析及產酶菌的篩選與鑒定［J］.中國農業科學，2011，44(12):2575-2581.

［5］ 高繪菊，路國兵，查傳勇，等.家蠶腸道產酶菌的分離與篩選［J］.蠶業科學，2007，33(2):228-233.

［6］ Shimizu S，Nakano M.Structural characterization of triacylglycerol in several oils containing gamma-linolenic acid［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2003，67(1):60.

［7］ 張樹政.酶制劑工業［M］.北京:科學出版社，1984.

［8］ 董明奇，史巖，姜春雷，等.脂肪酶高產菌株的篩選及酶學特性研究［J］.四川大學學報:自然科學版，2008，45(4):985-990.

［9］ 張搏，楊江科，蘇華武，等.脂肪酶產生菌的篩選、鑒定及其產酶條件優化［J］.生物技術，2007，17(1):23-26.

［10］ Macrae A R，Hammond A R.Present and future applications of lipase［J］.Biotech Genetic Eng Rev.，1985，(6):855-863.

［11］ Hobson P N，Summers R.Effect of growth rate on the lipase activity of a rumen bacterium［J］.Nature，1966，209(5024):736-737.

［12］ Altschul S F，Gish W，Miller W，et al.Basic local alignment search tool［J］.Journal of Molecular Biology，1990，215(3):403-410.

［13］ Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The CLUSTALX windows interface:Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］.Nucleic Acids Research，1997，25(24):4876-4882.

［14］ 孟玲，王惠.脂肪酶產生菌的篩選及產酶條件優化［J］.沈陽化工大學學報，2010，24(1):15-19.

［15］ 劉玉升，李明立，劉俊展，等.東亞飛蝗腸道細菌的研究［J］.中國微生態學雜志，2007，19(1):51-54.

［16］ Jaeger K E，Eggert T.Lipases for Biotechnology［J］.Current Opinion in Biotechnology，2002，13(4):390-397.

［17］ 譚有將，謝小燕，王群，等.克雷伯脂肪酶產生菌產酶條件優化及其粗酶性質研究［J］.江蘇農業科學，2010，(4):355-357.