100～700 mL液體培養基的微波滅菌效果觀察

梁瑩，梁薇，鄧毛子

(1.咸寧學院基礎醫學院病原系實驗室，湖北咸寧437100;2.肇慶學院體育與健康學院，廣東肇慶526061)

目前，醫院對醫療藥品、器械的微波消毒與滅菌頻率多為2 450 MHz的箱式微波爐，因為此類裝置與頻率更適宜于對小型和批量物品的處理［1］。關于培養基微波滅菌的報道已有不少，但是，有關照射過程中沸點時間上的滅菌效果還未見報道。本實驗室采用2 450 MHz，700 W微波爐對少量液體培養基進行3種狀態的沸點時間滅菌效果觀察，主要為快速消毒或在緊急的沒有高壓消毒滅菌器的情況下，提供可靠的更充足更有效的最佳滅菌數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌枯草桿菌黑色變種芽胞菌片ATCC9372(Bacillus subtilus var.mucoides)生物指示劑，染菌量1.0×108cfu/片，北京鑫四環消毒技術開發中心研制。金黃色葡萄球菌ATCC25923(Staphyloccocus aureus)、大腸埃希菌ATCC25922(Escherichia coli)、普通變形桿菌ATCC49132(proteus vulgaris)，華中科技大學同濟醫學院醫學微生物學教研室提供。

1.1.2 培養基營養瓊脂(生化試劑BR北京奧博星生物技術有限責任公司);普通液體培養基(由本室提供);微量糖管(葡萄糖、乳糖、甘露醇、尿素均來自杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.1.3 試劑蛋白胨(生化試劑，BR北京奧博星生物技術有限責任公司)、牛肉膏粉(生化試劑，杭州天和微生物試劑有限公司)、NaCl(分析純，西安化學試劑廠)、NaOH(分析純，西安化學試劑廠)、pH試紙(天津塘沽化學試劑廠)、電子天平(上海精天電子儀器有限公司)。革蘭染液、鞭毛染液(由本室按《病原生物學實驗教程》［2］配制)。

1.1.4 設備格蘭仕微波爐(P7021TP-6型，700 W，2 450 MHz，佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司)、電熱恒溫培養箱(DHP-9082D型，上海申賢恒溫設備廠)、全自動不繡鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器(上海三申醫療器械有限公司)、垂直流超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 供試菌懸液的制備將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、普通變形桿菌及枯草桿菌黑色變種芽胞菌片1片分別放入2 mL無菌普通液體培養基中，置37℃的恒溫箱中培養24 h，復活后，接種于普通營養瓊脂平板培養基上，置37℃恒溫箱中培養24 h，連續傳代3次增強細菌的活力。再用無菌普通肉湯配成濃度為1×109cfu/mL［3］的菌液，參照衛生部《消毒技術規范》［4］(2002版)中規定操作方法進行，保存于4℃冰箱，備用。

1.2.2 普通營養瓊脂平板的制備按照營養瓊脂瓶上的說明，用電子天平稱取營養瓊脂粉90 g，加入2 000 mL蒸餾水，加熱煮沸溶解，分裝500 mL三角瓶中，高壓蒸汽滅菌后，每個無菌平皿倒入20 mL，備用。

1.2.3 普通液體培養基的制備［5］用電子天平稱取NaCl 5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，蒸餾水1 000 mL，以此比例配制實驗所需用量，加熱徹底溶解后，用NaOH調pH值為7.5，過濾，用250 mL三角瓶分裝，每瓶100 mL，包裝好，取29瓶高壓蒸汽滅菌，備用。其他需用量直接用于微波滅菌實驗。將高壓蒸汽滅菌后的肉湯倒入3支試管，每管2 mL，備用。

1.2.4 微波對液體培養基沸騰點時間測試將100 mL的液體培養基設置為7個測試組，第1組100 mL×1瓶，第2組100 mL×2瓶，第3組100 mL×3瓶，第4組100 mL×4瓶，第5組100 mL×5瓶，第6組100 mL×6瓶，第7組100 mL×7瓶(微波爐最大容量)。設定微波高火。試驗前三角燒瓶的棉塞要注入1 mL蒸溜水，防止棉塞干枯。實驗主要觀察每組被照射的液體培養基中液體表面沸騰所需的時間、液體底部開始沸騰所需的時間及所有瓶完全沸騰所需的時間，結果見表1。測試完成后，每組液體培養基倒出3支試管，每管2 mL。同時取1 mL分別加入無菌瓊脂平板中，設3個重復。均置37℃恒溫箱培養24 h，觀察有無細菌生長，結果見表2。

1.2.5 微波殺滅芽胞桿菌效果的試驗實驗分組與1.2.4相同，將濃度為1×109cfu/mL的枯草桿菌黑色變種芽胞菌菌液1 mL，分別加入經高壓蒸汽滅菌的100 mL液體培養基中，每組分別按微波照射后不生長細菌的最后時間4.5、5.0、7.0、9.0、12.0、19.0、25.0 min進行試驗，分別置微波高火作用，同時另一瓶100 mL加菌液不照射，作陽性對照，均置37℃恒溫培養箱培養24 h后，各組倒3支肉湯管，每管2 mL。并取1 mL分別加入瓊脂平板中，設3個重復，37℃恒溫培養箱培養24 h，肉眼觀察有無細菌菌落在瓊脂平板上生長。

1.2.6 液體培養基無菌檢測及保質有效期試驗 將有效時間被滅菌的試驗組肉湯培養基、高壓滅菌過的微波殺滅芽胞桿菌試驗組液體培養基及各試驗組瓊脂平板放置于37℃恒溫培養箱連續觀察7 d，置室溫約20℃空氣流通少的地方，連續觀察15 d的變化。

1.2.7 微波作用的液體培養基質量檢測將微波作用后達到滅菌效果的各試驗組肉湯管及對照組高壓蒸汽滅菌后的肉湯管分別接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌，置于37℃恒溫培養24 h觀察其生長特征。然后，①分別將它們轉種無菌瓊脂平板中，置37℃恒溫培養箱培養24 h，觀察菌落生長情況;②分別進行革蘭染色［6］及鞭毛染色［7-8］，具體操作見《病原學與免疫學實驗教程》和《醫學微生物學實驗指導》。完成后油鏡下觀察形態、大小、染色性;③分別進行微量糖管葡萄糖發酵試驗、苷露醇試驗、克氏雙糖試驗、尿素酶試驗等生化反應，觀察微量糖管中測試菌的分解能力、產酸產氣、顏色等有無變化。

2 結果與分析

2.1 微波對液體培養基沸點的各時間及滅菌效果

表1 各測試組微波照射沸點時間Table 1 The boiling time of all test grorp

表2 各測試組沸點時間細菌生長情況Table 2 The bacterial growth phenomenon of all test group at different boiling time

由表1、表2可知，液體培養基在微波照射下取得3種狀態的沸騰時間。在表面沸騰時間及液體底部開始沸騰時間上瓊脂平板及肉湯管均有細菌生長，管中液體均勻混濁，瓊脂平板生長灰白色大小不等的菌落。在全部各瓶完全沸騰的時間上瓊脂平板及肉湯管均無細菌生長，管中液體清亮，平板無菌落。

2.2 微波殺滅芽胞桿菌效果的試驗

枯草桿菌黑色變種芽胞菌在高壓滅菌的各肉湯管中，經4.5、5.0、7.0、9.0、12.0、19.0、25.0 min微波有效時間的作用后，接種在瓊脂平板及肉湯試管中均無細菌生長，肉湯管中液體清亮。陽性對照管液體混濁，管底有絮狀沉淀，瓊脂平板表面形成圓形、粗糙、灰白色菌落。

2.3 無菌檢測及保質有效期試驗

通過7 d的無菌檢測和在20℃左右室溫下連續觀察15 d，照射后的肉湯培養基及瓊脂平板上均無細菌生長。肉湯管清亮，無混濁現象。

2.4 液體培養基質量檢測

2.4.1 接種測試菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌在試驗組肉湯管及對照組肉湯管中均呈均勻混濁狀態生長。在無菌瓊脂平板中，金黃色葡萄球菌均為菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1～2 mm，金黃色;大腸埃希菌均為圓形凸起，直徑2～3 mm的光滑型灰白色菌落;普通變形桿菌均呈擴散生長，接種部位為中心的厚薄交替的灰白色波紋狀菌苔。由此可見，同一菌株在不同培養基上的生長現象無明顯差異。

2.4.2 革蘭染色將試驗組肉湯管及對照組肉湯管中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌分別進行革蘭氏染色及鞭毛染色后，油鏡下觀察到:金黃色葡萄球菌均為G+，球型，直徑0.8 μm左右，排列成葡萄串狀，無鞭毛的球菌;大腸埃希菌均為G-短桿菌，大小0.5 μm×(1～3)μm。具有周鞭毛;普通變形桿菌均為G-兩端鈍圓的小桿菌，大小(0.4～0.6)μm×(1.0～3.0)μm，具有周鞭毛。由此，試驗組肉湯管和對照組肉湯管上的細菌形態染色特征均無明顯差異。

2.4.3 微量糖管試驗金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌在試驗組各肉湯管及對照組各肉湯管培養后各試驗菌的生化反應:金黃色葡萄球菌均分解葡萄糖，產酸不產氣;分解甘露醇產酸，分解尿素;大腸埃希菌均分解葡萄糖、乳糖產酸產氣，分解甘露醇，不分解尿素;普通變形桿菌均分解葡萄糖產酸產氣，不分解乳糖，分解甘露醇和尿素。

3 討論

100～700 mL液體培養基在2 450 MHz，700 W的微波照射下得到3種狀態的沸騰時間(表1)，表面沸騰到底部沸騰這2個時間都不能有效殺滅細菌。隨著整個被照射的培養基完全沸騰，為最佳的滅菌時間，也是達到最有效的滅菌效果(表2)。這可能就是熱效應及非熱效應。當生物體受到微波輻射時，微波透射生物體被吸收后所產生的綜合生物效應結果［9］。

利用國際通用消毒生物指標菌枯草桿菌黑色變種芽胞菌對被微波照射的液體培養基進行質控，并嚴格按照衛生部的《消毒技術規范》執行。本實驗結果表明，枯草桿菌黑色變種芽胞菌在液體培養基中被微波有效地全部殺滅，說明微波作用不但能殺滅細菌的繁殖體，更能殺滅細菌的芽胞，并且無菌檢測7 d未見長菌，室溫保存15 d無細菌生長，完全符合《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》(GB15981-1995)的國家標準。而金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及普通變形桿菌作為質檢菌，經過革蘭染色及鞭毛染色、分離接種培養、生化反應等一系列實驗，證明被作用后的液體培養基的營養成分沒有受到影響，細菌的形態染色特征、細菌的生長特性、細菌的分解能力均在正常范圍內。

據報道，利用2 450 MHz，700 W微波消毒母乳，可以預防南美洲錐蟲病［10］;應用微波輻射處理工業廢水，能殺滅大腸埃希菌、沙門菌、葡萄球菌、綠膿桿菌和旋毛(線)蟲等微生物［11］。谷小燕等［12］報道，可將微波滅菌后的方盒替代臨床治療護理中的無菌盤;王瑞等［13］報道，用微波對麥苗粉殺菌有利產品品質和營養成分的保持。資料表明，微波消毒滅菌不但可在醫療衛生方面廣泛應用，而且已經逐漸深入到工業、農業、食品等各個領域。

本文通過實驗表明，滅菌量與滅菌時間成正比，隨著滅菌定量的增高，滅菌時間也隨著相應增長，但未見有規律的時間變化，這可能與微波爐內的空間、分裝液體的三角瓶玻璃厚薄有關，微波的滅菌機制較為復雜，有待進一步的研究討論。盡管如此，微波爐用于液體培養基的消毒滅菌還是最安全可靠、方便快捷、經濟實惠的一種方法，具有較高的實用價值，值得廣泛推廣。

［1］ 張穎，王仙園，周娟，等.微波消毒技術研究進展［J］.中國消毒學雜志，2008，25(6):653-654.

［2］ 訾自強.病原生物學實驗教程［M］.北京:人民衛生出版社，2009.

［3］ 劉波，李紅，姚粟，等.枯草芽胞桿菌黑色變種ATCC 9372的特性及其應用［J］.中國消毒學雜志，2009，26(2):236-237.

［4］ 中華人民共和國衛生部.消毒技術規范［M］.北京:人民衛生出版社，2002.

［5］ 孫劍剛，鄧毛子.醫學微生物學實驗教程［M］.北京:科學出版社，2011.

［6］ 姚旌旗，覃金紅，孫劍剛.病原學與免疫學實驗教程［M］.北京:科學出版社，2007.

［7］ 于愛蓮.醫學微生物學實驗指導［M］.北京:人民衛生出版社，2005.

［8］ Murray RGE，Doetsch RN，Robinow CF.Determinative and cytological light microscopy.In:Gerhardt P，Murray RGE，Wood WA and Krieg NR.Mehthods for general and molecular bacteriology.American So-ciety for Microbiology.Washington DC，1994:35-36.

［9］ 左映平.微波在食品工業中的應用進展［J］.廣西輕工業，2010，3(3):9-10.

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［11］ Martin DI，Margaritescu I，Cirstea E，et al.Application of accelerated electron beam and microwave irradiation to biological waste treatment［J］.Vacuum，2005，77(4):501.

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［13］ 王瑞，張慜，范柳萍，等.麥苗粉的微波殺菌［J］.食品與生物技術學報，2009，28(2):150-155.