雙歧桿菌絲狀體生長形態(tài)初探

劉艷霞，劉蕾，劉俊康，鄧渝

(第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗系生物波研究中心，重慶400038)

細(xì)菌在不同環(huán)境條件下，生長形態(tài)和增殖方式可能發(fā)生改變，這是細(xì)菌對抗不利環(huán)境的一種適應(yīng)性變化形式。國內(nèi)學(xué)者在這方面做過大量研究，賈繼輝等［1］研究報道幽門螺桿菌在抗生素、酸性環(huán)境等不利條件下會出現(xiàn)絲狀體生長形態(tài);大腸埃希菌在體外抗生素后效應(yīng)期間菌體顯著延長，呈絲狀體［2］;王麗平等［3］將多種抗生素體外作用于大腸埃希菌，觀察發(fā)現(xiàn)氨芐西林和阿莫西林以不同濃度作用大腸埃希菌后，可使菌體產(chǎn)生絲狀體，2種藥使菌體發(fā)生絲狀變化的程度不一，尤以氨芐西林更甚，而慶大霉素和阿米卡星作用大腸埃希菌后，菌體形態(tài)未發(fā)生變化，但菌量明顯下降。前人研究多集中在抗生素對致病微生物形態(tài)的影響方面，對雙歧桿菌在特殊環(huán)境下生長形態(tài)和增殖方式變化的研究報道較少。雙歧桿菌作為腸道正常菌群的重要組成，可發(fā)揮穩(wěn)定正常菌群、抗條件致病菌、抗腫瘤、合成維生素、增強機體免疫力、減少醫(yī)院感染發(fā)生等多方面效應(yīng)［4］，是保護腸道的生物屏障之一，研究其生長和增殖狀態(tài)對維護機體健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)，本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基改良BS培養(yǎng)基，參考文獻［5］方法配置。

1.1.3 試劑維生素E煙酸酯膠囊(北京賽科藥業(yè)有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號:0705009);維生素B6片(湖北華中藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號:20071204)。

1.1.4 儀器Olympus多功能顯微鏡(BX41);原子力顯微鏡(SPI3800N-SPA400)。

1.2 方法

1.2.1 藥敏紙片制備無菌生理鹽水將維生素B6片配制成濃度1 mg/mL和10 mg/mL的溶液，分別取5 μL滴加在直徑5 mm的藥敏實驗專用紙片上制備成藥敏紙片A和B備用。無菌生理鹽水將維生素E煙酸酯膠囊配制成100 mg/mL溶液，取5 μL滴加在直徑5 mm的藥敏實驗專用紙片上制備成藥敏紙片C備用。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)將青春雙歧桿菌制成濃度為1×104/mL的細(xì)菌懸液，取50 μL均勻涂布于改良BS培養(yǎng)基平板上，待平板表面略干將藥敏紙片A、B和C分別置于3個平板中央，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，分別挑取藥敏紙片周圍單菌落進行革蘭染色，觀察細(xì)菌生長情況。同時，將藥敏紙片A、B和C放置在同一平板中邊長為3 cm的等邊三角形的3個頂點上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取三角形區(qū)域內(nèi)單個菌落革蘭染色觀察細(xì)菌生長情況。再將三角形區(qū)域內(nèi)單個菌落制備成1×104/mL菌懸液，取50 μL轉(zhuǎn)種培養(yǎng)于改良BS培養(yǎng)基平板上，厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單個菌落革蘭染色觀察。取上述雙岐桿菌單個菌落連續(xù)轉(zhuǎn)種3次于改良BS培養(yǎng)基培養(yǎng)，革蘭染色觀察細(xì)菌生長情況。1.2.3原子力顯微鏡樣本收集與檢測方法將待觀察的單個菌落樣本用無菌生理鹽水稀釋，制備成200 μL細(xì)菌懸液，吸取少量細(xì)菌懸液，小心滴于新解離的云母片上，1.5%戊二醛室溫固定5 min，再用超純水漂洗，空氣中風(fēng)干，日本精工SPI3800N-SPA400型原子力顯微鏡在室溫大氣環(huán)境中對雙歧桿菌生長形態(tài)進行掃描觀測。圖像均在輕敲模式(tapping mode)下獲得，探針為SIAF01(微懸臂長200 μm，彈性系數(shù)0.12 N/m)，力常數(shù)為0.2 N/m，掃描參數(shù)為X:115 μm、Y:115 μm、Z:29.97 μm。

2 結(jié)果與分析

2.1 革蘭染色觀察雙歧桿菌生長情況

青春雙歧桿菌在改良BS培養(yǎng)基上常規(guī)培養(yǎng)的生長增殖正常，細(xì)菌形態(tài)如圖1A所示。在維生素B6藥敏紙片A、維生素B6藥敏紙片B及維生素E煙酸酯藥敏紙片C單獨作用的條件下，雙歧桿菌生長增殖方式未發(fā)生改變。但在維生素B6和維生素E煙酸酯聯(lián)合作用下，三角形區(qū)域內(nèi)的雙歧桿菌菌落出現(xiàn)明顯的絲狀體生長形態(tài)，結(jié)果如圖1B所示。將三角形區(qū)域內(nèi)單個菌落第1次轉(zhuǎn)種培養(yǎng)于改良BS培養(yǎng)基平板上，厭氧培養(yǎng)48 h后雙歧桿菌仍保持絲狀體群集生長的現(xiàn)象。連續(xù)轉(zhuǎn)種3次后，革蘭染色觀察到雙歧桿菌絲狀體生長現(xiàn)象消失，恢復(fù)到常規(guī)培養(yǎng)時的菌體形態(tài)。

圖1 雙歧桿菌革蘭染色結(jié)果Fig.1 Gram stain results of Bifidobacterium

2.2 原子力顯微鏡掃描觀察雙歧桿菌增殖模式

通過原子力顯微鏡掃描方法，分別觀察了青春雙歧桿菌在改良BS培養(yǎng)基上常規(guī)培養(yǎng)的生長狀態(tài)(圖2A);在維生素B6和維生素E煙酸酯聯(lián)合作用下，絲狀體生長形態(tài)的雙歧桿菌二分裂增殖方式受到抑制(圖2B)。連續(xù)轉(zhuǎn)種3次后，恢復(fù)到常規(guī)培養(yǎng)時的生長狀態(tài)。

圖2 雙歧桿菌原子力顯微鏡掃描結(jié)果Fig.2 Atomic force microscope scan results of Bifidobacterium

3 討論

近年來，隨著益生菌在食品中的應(yīng)用，菌體穩(wěn)定性受到重視。Saarela等［6］研究發(fā)現(xiàn)，紫外誘導(dǎo)酸敏感的雙歧桿菌株B.breve 99發(fā)生突變再結(jié)合低pH值培養(yǎng)能夠增強該菌株對有機酸的耐受性，提高菌株在低pH果汁中的穩(wěn)定性。Shah等［7］研究維生素和抗氧化劑增強果汁中益生菌穩(wěn)定性的效果，發(fā)現(xiàn)白葡萄籽提取物、綠茶提取物及維生素C能夠增強雙歧桿菌(HOWARU Bifidobacterium lactis HN001)等3種益生菌在模擬果汁培養(yǎng)體系(初始pH 3.8)中的穩(wěn)定性，而維生素B2、B3、B6和維生素E單獨使用未發(fā)現(xiàn)增強菌體穩(wěn)定性的效果。

上述研究均關(guān)注菌體的存活數(shù)量，未關(guān)注形態(tài)變化。本研究中觀察到，雙歧桿菌在維生素B6和維生素E煙酸酯聯(lián)合作用下出現(xiàn)絲狀體生長形態(tài)且二分裂增殖受到抑制，轉(zhuǎn)種1至2次于正常培養(yǎng)基上仍可維持群集生長的特性，轉(zhuǎn)種3次后恢復(fù)正常生長形態(tài)，絲狀體群集生長現(xiàn)象消失，說明外界環(huán)境的改變可對雙歧桿菌的形態(tài)和增殖方式產(chǎn)生較大影響，這種形態(tài)和增殖方式上的改變可能導(dǎo)致雙歧桿菌活性發(fā)生相應(yīng)變化，從而影響機體腸道微生態(tài)環(huán)境。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在化療藥物5-氟尿嘧啶作用下，雙歧桿菌菌體加長，斷裂減少，轉(zhuǎn)變成絲狀體，長度在10 μm以上，這些絲狀體在正常的生長條件下又可以恢復(fù)正常生長，表明化療藥物可以直接影響雙歧桿菌的生長，而雙歧桿菌對化療藥的作用可產(chǎn)生顯著的適應(yīng)性變化［8］，而將雙歧桿菌暴露于有氧環(huán)境或敏感抗菌藥物作用下，亦可生成特殊形態(tài)的菌體，這種形態(tài)的改變常常伴隨有正常的細(xì)菌菌體的自溶，一方面可以認(rèn)為它們是不利環(huán)境的產(chǎn)物，另一方面也可以認(rèn)為它們是對這種不利環(huán)境有抵抗力的個體［9］，即可能是增加菌體穩(wěn)定性的途徑之一。

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快及生活方式的改變，環(huán)境污染、心理壓力、藥物濫用等因素都會對人體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響，并將直接或間接影響腸道重要生理菌群雙歧桿菌的生長，這種影響可導(dǎo)致雙歧桿菌出現(xiàn)各種適應(yīng)性的生長和增殖方式，本實驗結(jié)果為認(rèn)識雙歧桿菌的適應(yīng)性生長和增殖提供了實驗基礎(chǔ)。維生素B6和維生素E煙酸酯聯(lián)合作用下雙歧桿菌的生長增殖方式發(fā)生變化的具體機制有待進一步研究，這種適應(yīng)性生長增殖模式的改變對腸道及人體的影響等有關(guān)問題尚需進一步探討。

［1］ 賈繼輝，張茂修，周亞濱，等.幽門螺桿菌絲狀體的形成和回復(fù)性的研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2004，42(1):1-8.

［2］ 朱曼，王睿，張永青，等.加替沙星和環(huán)丙沙星體外抗生素后效應(yīng)期間大腸埃希菌形態(tài)學(xué)觀察及膜電位和膜通透性變化［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10(9):1005-1009.

［3］ 王麗平，郭永剛，史曉麗，等.不同抗生素對大腸埃希菌形態(tài)的影響及其誘導(dǎo)游離內(nèi)毒素的釋放［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2004，24(6):596-599.

［4］ Vinderola CG，Medici M，Perdigon G.Relationship between interaction sites in the gut，hydrophobicity，mucosal immunomodulating capacities and wall protein profiles in indigenous and exogenous bacteria［J］.J Appl Microbiol，2004，96(2):230-243.

［5］ Wang Z，Xiao G，Yao Y，et al.The role of Bifidobacteria in gut barrier function after thermal injury in rats［J］.J Trauma，2006，61(3):650-657.

［6］ Saarela M，Alakomi HL，M?tt? J，et al.Improving the storage stability of Bifidobacterium breve in low pH fruit juice［J］.Int J Food Microbiol，2011，149(1):106-110.

［7］ Shah NP，Ding WK，F(xiàn)allourd MJ，et al.Improving the stability of probiotic bacteria in model fruit juices using vitamins and antioxidants［J］.J Food Sci，2010，75(5):M278-82.

［8］ 劉俊康，鄧渝，吳小蘭，等.雙歧桿菌在5-氟尿嘧啶作用下的適應(yīng)性變化［J］.世界華人消化雜志，2006，14(32):3139-3142.

［9］ 劉俊康，閆國華，鄧渝，等.雙歧桿菌屬潛生體的初步實驗研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17(5):513-515.