嗜鹽古菌噬菌體研究進展

梅運軍，沈萍，陳向東*

(1.武漢工業(yè)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430023;2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)國家重點實驗室，湖北武漢430072)

噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱。據(jù)統(tǒng)計，截止2009年，已對5 500多株噬菌體進行了電鏡觀察，隸屬于1目，17科［1］。近年的研究表明，噬菌體是一個龐大的生物群體，其總量超過了1030，并廣泛分布于地球的各種環(huán)境中;而對古菌噬菌體的研究至今知之甚少，目前僅有50多株古菌噬菌體被報道，這些古菌噬菌體絕大多數(shù)來源于嗜熱或極端嗜鹽的環(huán)境中［2］。對于嗜鹽古菌噬菌體的研究起源于上世紀70年代，Hs1是第1株被報道的嗜鹽古菌噬菌體，隨后Zillig及其同事對嗜鹽古菌噬菌體ΦH進行了深入的研究，Dyall-Smith及Bamford領(lǐng)導(dǎo)的課題組在嗜鹽古菌噬菌體研究方面也作出了巨大的貢獻。然而，與細菌噬菌體研究相比較，對嗜鹽古菌噬菌體的研究尚處在起步階段，表1列出了部分研究較為深入的嗜鹽古菌噬菌體。本文簡要綜述了嗜鹽古菌噬菌體的形態(tài)及特性、分子生物學(xué)研究、嗜鹽古菌噬菌體的分離及多樣性研究方法等方面的進展。

1 嗜鹽古菌噬菌體形態(tài)及特性

1.1 球形噬菌體

SH1為1株典型的嗜鹽古菌球形噬菌體，如圖1所示。其直徑大約為70 nm，能感染宿主Haloarcula hispanica并形成清晰的噬菌斑［3］，密度為1.33 g/mL，蛋白質(zhì)衣殼由15種蛋白組成，分子量4～185 ku。就其外形而言，SH1類似于其他古菌噬菌體(PSV、TTSV1、STIV)以及細菌噬菌體PRD1，但幾者之間存在一定的區(qū)別。其中，PSV和TTSV1具有相似的形態(tài)和基因組特征，核衣殼被脂膜外殼包裹，為雙鏈線性DNA，PSV基因組末端具有反向重復(fù)序列，2條DNA鏈在末端共價結(jié)合［4］。SH1與STIV均為二十面體球狀線性雙鏈DNA噬菌體，與PSV、TTSV1不同的是SH1、STIV內(nèi)部有一脂質(zhì)層［5］。SH1與PRD1最為相似，不僅表現(xiàn)在蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)有一脂質(zhì)層，基因組為線性雙鏈DNA，而且基因組大小和組織結(jié)構(gòu)也極為相似［6］。

表1 部分嗜鹽古菌噬菌體特性Table 1 Summary of partial halophages characteristics

1.2 紡錘形噬菌體

紡錘形(也稱檸檬形)噬菌體是指一類形似紡錘、一端或兩端有短尾的噬菌體。就目前已報道的紡錘形噬菌體而言，均來自泉古生菌界和廣古生菌界。其中，His1和His2是能感染同一嗜鹽古菌Haloarcula hispanic且一端具有短尾的紡錘形噬菌體，如圖2所示，在分類上歸于Salterprovirus屬。His1(44 nm×77 nm)與His2(44 nm×67 nm)大小相似，密度相近(His1ρ=1.28 g/mL，His2ρ=1.30 g/mL)，基因組皆為線性雙鏈DNA，His1基因組由14 464 bp組成，His2由16 067 bp組成，G+C的摩爾百分比為40%，基因組末端具有反向重復(fù)序列并含有末端結(jié)合蛋白，缺少DNA整合酶編碼基因［7］。盡管兩者如此相似，但在基因組的堿基排列上存在很大的差別;在蛋白質(zhì)(經(jīng)開放閱讀框預(yù)測)水平上除了DNA聚合酶具有相似的氨基酸殘基外(42%的一致性)，其他預(yù)測蛋白都不具有明顯的相似之處。His2噬菌體顆粒衣殼蛋白由4種主要的蛋白組成—VP1、VP2、VP3、VP4，其大小分別為62、36、28、21 ku。

1.3 頭尾形噬菌體

典型的頭尾形噬菌體是由二十面體的頭部以及螺旋對稱的可伸縮或不可伸縮的尾部組成，尾部包括尾髓、尾鞘、尾板、尾刺和尾絲。此類噬菌體廣泛存在于嗜鹽古菌中，包括Hh1、Hh3、Ja.1、Hs1、ΦH、ΦN、ΦCh1、S45、S5100、B10、SNJ1、HF1、HF2等，其中，ΦH、ΦCh1、S5100、HF1、HF2具有明顯可伸縮的尾部，Hh1、Hh3、Ja.1、Hs1、ΦN、S45、B10、SNJ1尾部不可伸縮，典型的嗜鹽古菌頭尾形噬菌體代表如圖3所示。除基因組未知的嗜鹽古菌噬菌體B10、S45、Ja1外，其余基因組皆為線性、雙鏈DNA，有趣的是在ΦCh1蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)還包含有一段宿主的RNA核苷酸序列，大小在80～700 bp。在分類學(xué)上，ΦCh1、HF1、HF2屬于Myoviridae科。

圖3 嗜鹽古菌頭尾形噬菌體(標尺:100 nm)Fig.3 Head-tail halophages(bar:100 nm)

1.4 其他形狀的噬菌體

除了常見的3種形狀的噬菌體之外，在一些鹽濃度較高的環(huán)境水樣中，還存在其他形狀的噬菌體顆粒，如發(fā)夾形、絲狀、鏈狀、鉤狀、蝌蚪狀、蘆葦狀以及復(fù)雜結(jié)構(gòu)的噬菌體顆粒［8］，見圖4。

圖4 其他形狀的噬菌體(標尺:100 nm)Fig.4 Other morphologies of halophages(bar:100 nm)

然而，對這些形態(tài)各異的噬菌體的研究目前僅局限于形態(tài)學(xué)的報道，其他方面的研究有待于進一步的深入。

2 嗜鹽古菌噬菌體分子生物學(xué)研究

對嗜鹽古菌噬菌體分子生物學(xué)的研究起源于上世紀80年代后期，ΦH為1株具有頭尾結(jié)構(gòu)的溫和型噬菌體，基因組大小為59 kb雙鏈DNA，除甲基化酶基因之外，該噬菌體基因組序列與細菌、噬菌體或真菌病毒的基因組序列很少有相似之處，直到另一株嗜鹽古菌噬菌體ΦCh1基因組測序完成，兩者在核苷酸序列上相似性為97%，而且在開放閱讀框上噬菌體ΦCh1與ΦH也非常相近［9-10］。90年代初，Dyall-Smith及其研究團隊在嗜鹽古菌噬菌體方面做了大量的工作，發(fā)現(xiàn)并比較深入地研究了His1、His2、HF1、HF1和SH1，涉及噬菌體基因組組成及結(jié)構(gòu)、衣殼蛋白及轉(zhuǎn)錄等各方面［3，6，11-16］。在基因結(jié)構(gòu)及組成上以HF1、HF2為例，兩者具有相似的基因組大小(大約77 kb)，而且通過交叉雜交分析發(fā)現(xiàn)兩者基因組序列具有80%一致性;基因組測序完成后，兩者在序列上的異同更加清晰。

圖5 HF1與HF2基因組的圖形比對Fig.5 Graphical alignment of HF1 and HF2 genomes

圖5示意了HF1與HF2基因組的結(jié)構(gòu)以及兩者基因組比對情況，圖中兩基因組示意圖間的垂直短線表示兩者基因組中存在的堿基替換的位置，深黑色和不連續(xù)線條分別表示插入和缺失的序列。顯然，兩者基因組前48 kb(大約基因組60%)除了1個堿基的差異外，其余部分完全一致，但是剩下部分的基因組有非常明顯的差異，只有87%的一致性。研究認為，造成序列差異的原因主要是在嗜鹽古菌中基因重組現(xiàn)象普遍存在，因此HF1與HF2序列間的差異可能是HF1或HF2與另外一類HF類似的噬菌體間發(fā)生了重組，導(dǎo)致部分序列被取代;而且HF1與HF2晚期表達的基因(如衣殼蛋白基因)存在于這些差異的序列中，致使衣殼蛋白存在差異，最終導(dǎo)致兩者侵染宿主上的不同［17］。

在復(fù)制方式HF2類似于大腸埃希菌噬菌體T3、T7，復(fù)制過程中基因組形成串聯(lián)中間體，在末端酶或包裝酶作用下將病毒基因組從串聯(lián)體上特異位點切割并進行核衣殼的包裝;而SH1復(fù)制方式類似于腺病毒及噬肝DNA病毒，以蛋白質(zhì)為引物引發(fā)DNA高效合成，但在整個噬菌體SH1的基因組中未發(fā)現(xiàn)編碼DNA聚合酶的基因，因此推測該病毒的復(fù)制過程依賴宿主的DNA聚合酶［12］。

在轉(zhuǎn)錄方面，與細菌噬菌體相比，嗜鹽古菌噬菌體也有許多特別之處，而古菌噬菌體間存在很多相似之處。對一般細菌噬菌體而言，轉(zhuǎn)錄分為前期轉(zhuǎn)錄、中期轉(zhuǎn)錄以及晚期轉(zhuǎn)錄3個階段，而已報道的嗜鹽古菌噬菌體SH1，通過RT-PCR分析轉(zhuǎn)錄分為早期和晚期過程，無明顯的中期時相，這一現(xiàn)象在其他古菌噬菌體中也有類似的報道，如SIRV1和SIRV2［14，18］;轉(zhuǎn)錄時，編碼衣殼蛋白的轉(zhuǎn)錄本在噬菌體感染的前期就已經(jīng)開始合成直至整個感染周期，只是這些結(jié)構(gòu)蛋白基因以及包裝ATP酶基因在感染的后期具有更高的轉(zhuǎn)錄［18］。在轉(zhuǎn)錄形式上，在噬菌體SH1的基因都以操縱子的形式被轉(zhuǎn)錄，類似于嗜熱古菌噬菌體SSV1，而且存在轉(zhuǎn)錄終止子通讀現(xiàn)象，在以往的RNA病毒以及古菌微衛(wèi)星病毒pSSVx中都有類似的報道［19-21］。另外，在感染的后期非編碼鏈有不同程度的轉(zhuǎn)錄，特別是出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄通讀后。這些非編碼鏈轉(zhuǎn)錄形成的轉(zhuǎn)錄本并不編碼功能性蛋白，推測在蛋白質(zhì)翻譯過程中起到翻譯調(diào)控的作用，在早期的研究中，也發(fā)現(xiàn)了嗜鹽古生菌噬菌體ΦH存在這種dsRNA和iRNA的調(diào)控作用，近年在古菌微衛(wèi)星病毒pSSVx中也有類似的反義RNA的調(diào)控作用［21］。盡管對嗜鹽古菌噬菌體分子生物學(xué)方面的研究取得了一定的成績，但是與細菌噬菌體以及真核生物的病毒相比，尚存很大差異，還需要大量的基礎(chǔ)研究。

3 嗜鹽古菌噬菌體分離及噬菌體群體研究方法

嗜鹽古菌噬菌體分離常采用如下3種方法:①實驗室敏感菌株分離法;②基因組脈沖場凝膠電泳分離法;③相分配法。其中，實驗室敏感菌株分離法是最常用的方法，就目前已報道的絕大部分嗜鹽古菌噬菌體均采用這種方法;但該方法也存在一些缺陷，如僅對烈性噬菌體有效，對溫和噬菌體卻失去了優(yōu)勢，由于目前報道的可作為敏感菌株的宿主有限，因此該方法只能檢測環(huán)境中的部分噬菌體［7，17］。基因組脈沖場凝膠電泳法是近來發(fā)展起來的一種分離環(huán)境樣品中嗜鹽古菌噬菌體基因組的方法，利用該方法雖然可以得到大量噬菌體的基因組序列，但噬菌體的形態(tài)以及噬菌體與宿主的動態(tài)關(guān)系卻一無所知［22-23］。相分配法主要借助噬菌體顆粒自身物理及化學(xué)性質(zhì)(如噬菌體顆粒大小或浮力密度等)而采取的必要的分離、純化噬菌體的步驟，該方法也常用到分離其他噬菌體上，但不同的是在分離嗜鹽古菌噬菌體時常采用高鹽的緩沖液作為調(diào)節(jié)滲透平衡的體系。

噬菌體群體研究主要采用的手段包括:①過濾法對樣品進行濃縮，結(jié)合透射電子顯微鏡或熒光電子顯微鏡對噬菌體形態(tài)進行觀察［24-25］;②脈沖場凝膠電泳法結(jié)合DNA雜交法對噬菌體基因組進行分析［23］;③宏基因組法對環(huán)境樣品進行噬菌體基因組多樣性分析［26］。

4 問題與展望

對嗜鹽古菌噬菌體的研究雖然取得了一定的成就，但與對細菌噬菌體研究相比尚處于研究的早期。在噬菌體形態(tài)多樣性研究方面，就目前報道紡錘體形、球形及星形噬菌體十分普遍，而頭尾噬菌體卻很少，主要原因在于檢測和分離方法不當(dāng)，如主要采用在實驗室利用有限的可培養(yǎng)的宿主菌對噬菌體分離(常利用Hbt.Salinarum作為宿主)，忽視了環(huán)境中噬菌體的多樣性;而對嗜鹽古菌噬菌體分子生物學(xué)的研究也僅僅局限于極個別噬菌體，缺少噬菌體基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的大量研究，不利于對噬菌體起源以及生命起源與進化的分析;對于這類特殊的噬菌體在生態(tài)中的地位以及與宿主的相互關(guān)系的研究也十分的薄弱，缺乏較為系統(tǒng)的研究。總之，隨著對嗜鹽古菌噬菌體研究的深入，人們將逐漸加深對自然界中這類特殊的噬菌體的了解，并為自然界中生命的起源與進化提供依據(jù)。

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