秸稈降解菌劑對秸稈還田土壤中細菌種群數量的影響

吳紅艷，王智學，陳飛，郭玲玲，修翠娟

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000)

我國是一個農業大國，秸稈資源十分豐富。秸稈是農作物的主要副產物，也是一種重要的生物資源。目前對于如何將秸稈合理利用的研究主要集中在以下3個方面:①直接將秸稈還田以增加土壤肥力;②利用微生物發酵農作物秸稈生產蛋白飼料;③用秸稈纖維素生產酒精和甲烷。隨著農業現代化的迅猛發展，秸稈還田特別是直接還田越來越受到重視。一方面是大規模的農業生產，秸稈需要就近處理，以節省勞力;另一方面，長期單純施用化肥不利于土壤肥力的發育。秸稈還田技術的效應主要表現在以下5個方面［1-2］:養分效應、改土效應、微生物學效應、經濟效應和環境效應。其中微生物學效應是十分重要的。土壤微生物是農業生態系統中重要的一員，具有分解有機物和凈化土壤的作用，土壤酶活是微生物活動的基本反應，秸稈還田激發了土壤微生物的生長［3］，改變了土壤微生物的生長狀況，提高了土壤有益微生物類群的數量，顯著地提高了土壤中脲酶、轉化酶和過氧化氫酶活性，加速了有機物質的分解和營養元素的礦化。整個過程中，土壤微生物量都處于動態的變化中［4］。研究秸稈降解專用菌種施用后耕層土壤微生物群落的動態變化規律，并總結這些變化規律與相關酶活性、地上植物生長情況和產量之間的關系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品實驗用土壤樣品為秸稈降解菌劑施用后定期取得。

1.1.2 土壤樣品采集時間秸稈降解菌劑施用后每15 d收取1次。

1.1.3 試劑DV805膠回收試劑盒、溶菌酶、Taq酶、丙烯酰胺、甲酰胺。

1.1.4 儀器高速冷凍離心機、恒溫水浴鍋、PCR儀、DGGE電泳系統(TV400)。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法去除表層土壤于秸稈上0～20 cm處采集。

1.2.2 土壤粗基因組DNA的提取［5］將1 g土壤加2 mL PBS(0.12 mol/L磷酸鈉緩沖液pH 8.0)，置于30℃搖床150 r/min振蕩15 min，5 000 r/min離心15 min，重復1次，取沉淀加溶解液1(0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA)1.5 mL、50 mg/mL溶菌酶0.5 mL，37℃水浴2～3 h后，加溶解液2(0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris，10%SDS)2 mL，-20℃冰浴、65℃水浴循環3次，5 000 r/min離心15 min，取上清與等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合物抽提2次，異丙醇沉淀，雙蒸水溶解。

1.2.3 土壤粗基因組DNA純化將1.2.2所提取的土壤基因組DNA進行低熔點瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖濃度為0.9%，在紫外燈下切取目的條帶置于EP管中，并利用DV805A膠回收試劑盒，按說明書進行純化回收。

1.2.4 土壤細菌16S rDNA V3區擴增引物為16S rDNA V3區擴增的通用引物并在其中加入GC夾子，序列為:W357:CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCCTACG GAGGCAGCAG，W518:ATTACCGCGGCTGCTGG。擴增體系見表1。

表1 擴增體系(20 μL)Table 1 System of amplification

擴增條件:采用降落式PCR，每個循環溫度降低0.5℃。

1.2.5 DGGE電泳分離土壤細菌16S rDNA V3擴增片段［6］①聚丙烯酰胺凝膠組成見表2;②DGGE電泳條件［7］:變性劑濃度為35%～55%，電壓為200 V，溫度60℃，蠕動泵流速為5 mL/min。

表2 聚丙烯酰胺凝膠組成Table 2 Composition of gel of polyacrglamide

2 結果與分析

2.1 土壤粗基因組DNA的提取結果

從土壤粗基因組DNA的提取結果可以看出，在片段大小為23 kb附近有1條濃度較高的DNA條帶，說明土壤中細菌豐度較高，可以進行純化、回收，并進行下一步相關實驗研究。

2.2 土壤粗基因組DNA純化結果

從土壤粗基因組DNA純化結果可以看出20 kb附近有1條濃度較高的DNA帶，濃度可以進行PCR擴增。

2.3 土壤細菌16S rDNA V3區擴增結果

從土壤細菌16S rDNA V3區擴增結果可以看出，在250 bp附近有1條濃度很高的DNA條帶，濃度大概在300 ng左右，純度為較單一條帶，即PCR產物完全可以用于DGGE電泳進一步分離，同時進行分析。

圖3 土壤細菌16S rDNA V3區擴增Fig.3 Results of amplification for 16S rDNA V3

2.4 DGGE電泳分離土壤細菌16S rDNA V3擴增片段結果

從DGGE電泳結果可以看出，在作物整個生長過程中，中期條帶較亮，表明濃度較高，后期逐漸變淡，說明菌落數量呈現前期上升、中期最高、后期逐漸降低的趨勢。同時秸稈降解菌劑施用后土壤樣品條帶與基質和空白對照相比條帶明顯明亮，條帶較粗，說明種群豐度較高。

圖4 DGGE電泳分離土壤細菌16S rDNA V3擴增片段Fig.4 Results of amplification for 16S rDNA V3 by DGGE

3 結論與討論

從本實驗研究結果并結合作物整個生長過程中纖維素酶、半纖維素酶、漆酶等相關活性定期檢測(酶活性與種群數量的關系另文敘述)結果可以得出初步結論，秸稈還田或者秸稈降解劑施入后土壤中種群數量有所增加，考慮原因可能是由于秸稈還田或者秸稈降解劑的施入對土壤中細菌種群起到了很好的激活作用［8］，使其總菌群數量增加，同時使土壤中的纖維素酶、半纖維素酶、漆酶等相關酶活性明顯提高，達到更好的降解秸稈的效果，并明顯提高了土壤的肥力，更好地促進了作物生長，從而起到增產的作用。

目前，雖然對秸稈還田在分解速度、增加土壤養分、改良土壤理化性質、降解秸稈的微生物種類和微生物產生的分解秸稈的主要酶等方面已進行了較深入的研究，但在微生物作用的不同階段優勢菌群的種類、秸稈全部還田后如何加速其降解以及菌落的演替規律等仍有許多方面需要利用分子生物學如DGGE電泳后進行切膠回收、序列測定、BLAST比對等手段進行相關研究。

研究表明，秸稈生物降解菌種能夠快速腐解秸稈，并能改良土壤，從而達到增產的效果，因而在秸稈還田同時按比例施入秸稈生物降解菌種，使秸稈快速腐熟，達到省工、省時的目的，此技術具有廣闊的發展前景。

［1］ 劉娣，范丙全，龔明波.秸稈還田技術在中國生態農業發展中的作用［J］.中國農學通報，2008，24(6):404-407.

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［3］ 周琳，張曉君，李國勛，等.DGGE/TGGE技術在土壤微生物分子生態學研究中的應用［J］.生物技術通報，2006，(5):67-71.

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［5］ 杜濤，黃小毛，侯明生，等.從土壤中提取DNA用于PCR擴增［J］.微生物學通報，2003，30(6):1-5.

［6］ 黃進勇，岳彩鵬，周偉.麥田土壤細菌群落16S rDNA V3片段PCR產物的DGGE分析［J］.河南農業大學學報，2007，41(4):396-400.

［7］ 卜元卿，黃為一.稻秸對土壤細菌群落分子多態性的影響［J］.土壤學報，2005，42(2):270-276.

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