刺參“腐皮綜合癥”致病菌LNUB415的分離及防治的初步研究

艾海新，于晶晶，鄭方亮，朱春玉，丁國(guó)偉，李鶴，劉宏生*

(1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110036;2.遼寧省生物大分子計(jì)算模擬與信息處理工程技術(shù)研究中心，遼寧沈陽(yáng)110036)

海參(Sea cucumber)屬于棘皮動(dòng)物門、海參綱、海參屬，位居“八珍”之一，是一種名貴的食品兼藥材。遼寧、山東海域所產(chǎn)刺參(Apostichopus japonicus)是海參中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的一種，為海參中的上品。刺參養(yǎng)殖業(yè)已成為環(huán)渤海海域繼海帶、對(duì)蝦、扇貝、海水魚(yú)養(yǎng)殖之后新興的水產(chǎn)養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)。隨著刺參養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，其病害發(fā)生也日趨嚴(yán)重。目前，遼寧海域產(chǎn)的幼參和成參主要疾病為“腐皮綜合癥”(俗稱化皮病)，多表現(xiàn)為附著力減弱，噴射內(nèi)臟，皮膚在不同部位出現(xiàn)腐爛并死亡［1］。由于抗生素易產(chǎn)生殘留，影響產(chǎn)品質(zhì)量安全，因此研發(fā)中草藥作為抗生素的替代品將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的發(fā)展前景。中草藥含有多種具有免疫調(diào)節(jié)作用的成分，如生物堿、多糖、皂苷、有機(jī)酸等，應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，已有很多報(bào)道。張耀武等［2］報(bào)道:將黃芩、板藍(lán)根、黃芪等混合飼料投喂黃顙魚(yú)，顯著提高黃顙魚(yú)生長(zhǎng)、血細(xì)胞的吞噬活性和溶菌酶活力。本研究從患病刺參腸道分離純化出多株細(xì)菌，從中篩選到1株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，病原菌經(jīng)分離純化后進(jìn)行了人工回接感染試驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)條件致病菌進(jìn)行病原學(xué)研究，并開(kāi)展了抗生素和中草藥免疫增強(qiáng)劑的篩選，該結(jié)果為進(jìn)一步研究遼寧海域海參刺參的病害和“腐皮綜合癥”的防治提供了理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

患病刺參取自大連普蘭店某刺參養(yǎng)殖場(chǎng)，體表呈大面積腐爛;用于人工感染的刺參，取自該養(yǎng)殖區(qū)健康幼參。

1.2 方法

1.2.1 顯微觀察和刺參腸道細(xì)菌分離首先肉眼觀察患病刺參病灶處，用接種環(huán)刮取腐爛部位，直接制成水浸片顯微鏡觀察，對(duì)細(xì)菌、霉菌、寄生蟲(chóng)的種類和數(shù)量進(jìn)行觀察和記錄，以初步確定可疑病原。在無(wú)菌條件下，取患病和健康刺參腸道組織，剪碎、勻漿。取100 μL勻漿液在無(wú)菌TSA固體培養(yǎng)基上均勻涂抹，28℃恒溫培養(yǎng)24～36 h，挑取培養(yǎng)基上的單菌落在TSA固體培養(yǎng)基上劃線分離，純化菌株。

1.2.2 病原菌的分類鑒定①形態(tài)及生理生化指標(biāo):將純培養(yǎng)的細(xì)菌在28℃下培養(yǎng)24 h后，觀察菌落及其形態(tài)，按常規(guī)方法進(jìn)行革蘭染色和電鏡觀察。根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］對(duì)純化菌株進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)定;②16Sr DNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù):挑取單菌落加入到50 μL無(wú)菌水中，混勻。100℃水浴加熱10 min后，于4℃下離心(11 000 r/min)10 min，取5 μL上清液為PCR反應(yīng)的模板。采用細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)［4］。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小(1.5 kb左右)后，將其送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序。將16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似性較高的序列，通過(guò)MEGA4.0軟件的鄰近相接法對(duì)測(cè)得的DNA序列與已知序列進(jìn)行聚類分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［5］。

1.2.3 人工感染試驗(yàn)將腸道分離的優(yōu)勢(shì)菌制成菌懸液，用注射法進(jìn)行人工回接感染試驗(yàn)。分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組2個(gè)平行，每個(gè)平行5頭刺參。實(shí)驗(yàn)組每頭刺參皮下注射菌懸液1 mL，菌懸液濃度為108、106、104cfu/mL，對(duì)照組注射1.5%的無(wú)菌生理鹽水。同時(shí)，將菌懸液100℃水浴20 min滅活取1 mL皮下注射。試驗(yàn)期間，水溫保持在14～16℃，鹽度18～22 g/L，日換水量1/3，充氣。連續(xù)觀察10 d，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 中草藥和藥敏紙片試驗(yàn)①中草藥制備:11種中草藥原料購(gòu)自沈陽(yáng)東北大藥房，分別是黃芪、連翹、大青葉、魚(yú)腥草等，將中草藥用粉碎機(jī)粉碎，分裝待用。取60 g中草藥倒入燒杯加入300 mL去離子水，浸泡2 h后煎煮，邊煮邊攪拌，煮沸后文火煮1 h，濾除煎液，共煎3次，合并濾液濃縮至30 mL，生藥含量為2 g/mL，121℃滅菌20 min后置于4℃冰箱中保存待用;②中草藥體外抑菌圈測(cè)定:取直徑90 mm的平板，注入加熱融化的TSA 7～9 mL，均勻攤布碟底，放置超凈工作臺(tái)，凝固后待用。將純菌落制成菌懸液，按照1∶20加入40℃固體TSA中，取7～9 mL均勻倒在已凝固的培養(yǎng)基上。凝固后每個(gè)平板放置滅菌牛津杯4個(gè)，取150 μL中草藥提取液加入牛津杯中，每個(gè)平板均做空白對(duì)照。28℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，并記錄抑菌圈直徑大小。每種藥做2個(gè)重復(fù)，測(cè)定記錄抑菌圈大小，取其平均值;③藥物敏感試驗(yàn):采用1.2.4中②方法制作上層混菌的培養(yǎng)基，將9種藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基上，每種藥敏紙片做2個(gè)重復(fù)，于28℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，并記錄抑菌圈直徑大小;④中草藥和抗生素人工感染試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組每組2個(gè)平行，每個(gè)平行5頭刺參。每頭刺參皮下注射菌懸液1 mL，菌懸液濃度為108、106、104cfu/mL，喂養(yǎng)后出現(xiàn)附著力下降的癥狀，將中草藥粉碎置于冰箱保存，使用前2 h按照4%量與飼料混合喂養(yǎng)。抗生素按照0.5%量與飼料混合喂養(yǎng)。對(duì)照組注射1.5%的無(wú)菌生理鹽水。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)菌的分離純化

感染的對(duì)象為幼參，主要癥狀為口部腫大，附著力減弱，噴射內(nèi)臟，皮膚潰爛直至死亡等。病參病灶組織的水浸片觀察，發(fā)現(xiàn)病灶處有大量細(xì)菌，無(wú)霉菌和寄生蟲(chóng)存在，可初步確定刺參患病由細(xì)菌感染引起。從病灶組織分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，標(biāo)記為L(zhǎng)NUB415。LNUB415在TSA上的菌落特征:圓形，乳白色，不透明，邊緣不整齊似毛玻璃狀，中間稍凸，表面半濕潤(rùn)，融蠟狀，革蘭陽(yáng)性，菌體長(zhǎng)桿狀，兩端較平整，多數(shù)呈鏈狀排列，大小為(0.8～1.0)μm×(3～5)μm。芽胞偏中生，橢圓形。通過(guò)形態(tài)觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定，可初步確定LNUB415為芽胞桿菌屬(Bacillus)的一種(表1)。

2.2 菌株LNUB415 16S rDNA序列分析

菌株LNUB415的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 465 bp。登陸NCBI，將獲得的序列進(jìn)行BLAST同源檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn):LNUB415與蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)具有99%同源性，表明LNUB415菌株為蠟樣芽胞桿菌屬。在GenBank中挑選芽胞桿菌屬的部分菌株16S rDNA基因序列，利用CLUSTAL X2.0和MEGA4.0軟件，N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖(圖1)。綜合形態(tài)學(xué)和生理生化測(cè)定，鑒定LNUB415為蠟樣芽胞桿菌。

表1 菌株LNUB415的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of bacterial strains LNUB415

圖1 根據(jù)16SrDNA序列同源性構(gòu)建的LNUB415的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of LNUB415 based on 16S rDNA sequence homology

2.3 人工感染結(jié)果

人工感染結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染刺參的癥狀與自然發(fā)病刺參的癥狀基本相同:首先，其觸手過(guò)度張開(kāi)，接著口部腫大，分泌粘液增多，肢體柔軟，管足附著力下降，有的個(gè)體有排臟現(xiàn)象;然后，口部或棘刺部位出現(xiàn)潰爛，潰爛處有白色絮狀物粘連，肛門處產(chǎn)生大量粘液，病情嚴(yán)重時(shí)開(kāi)始體表大面積潰爛，最終死亡。

LNUB415注射濃度為108cfu/mL的實(shí)驗(yàn)組A1在幼參感染后24 h出現(xiàn)腐爛，至48 h全部死亡;濃度為106cfu/mL的實(shí)驗(yàn)組A2在感染后36 h棘刺部位出現(xiàn)白點(diǎn)，出現(xiàn)局部腐爛;濃度為104cfu/mL的實(shí)驗(yàn)組A3在36 h后觸足無(wú)力，沉入池底;A4組將菌懸液100℃水浴20 min滅活取200 μL皮下注射，4 d后開(kāi)始出現(xiàn)腐爛，第7 d死亡9只(表2)。

表2 LNUB415人工感染試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of artificial infection experiment

2.4 中草藥和抗生素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 中草藥和藥敏試驗(yàn)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果中草藥水提物的抑菌圈大小見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，11種中草藥水提物對(duì)LNUB415的抑菌效果由強(qiáng)到弱為黃連、大黃、大青葉。可見(jiàn)黃連、大黃對(duì)LNUB415都具有較強(qiáng)的抑制作用。菌株LNUB415對(duì)生產(chǎn)中常用的9種抗菌藥物的敏感測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3，菌株LNUB415對(duì)鏈霉素、頭孢噻肟、頭孢哌酮、諾氟沙星敏感，對(duì)其他抗生素耐藥或中度敏感。

表3 11種中草藥的水提物體和9種抗生素體外抑菌圈Table 3 Inhibitory circles of 11 Chinese herbal medicine water extracts and 9 drugs sensitivity tests

2.4.2 中草藥和藥物人工感染試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果，將飼料與單方中草藥黃連(HL)混合，喂養(yǎng)已注射菌液濃度為108cfu/mL的試驗(yàn)組(見(jiàn)表2中B1組)，患病刺參死亡率下降至80%;濃度為106cfu/mL的B2組，喂藥后60 h出現(xiàn)死亡，喂養(yǎng)10 d死亡率為50%;濃度為104cfu/mL的B3組，喂藥后72 h出現(xiàn)患病癥狀，死亡率降低至30%，患病癥狀得到有效改善。藥物選擇諾氟沙星(NFLX)，按照比例與飼料混合，喂養(yǎng)患病刺參(見(jiàn)表2中B4組)，喂養(yǎng)10 d死亡率為20%，患病刺參的病情得到控制。

3 討論

“腐皮綜合癥”是刺參幼參和成參時(shí)期危害最為嚴(yán)重的疾病，該病的病原具有多樣性和地域性的特點(diǎn)。目前已報(bào)道的“腐皮綜合癥”病原，如燦爛弧菌(Vibrio splendidus)［6］、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)［7］和溶藻弧菌(Vibrio.alginolyticus)［8］、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonida)［9］、中間氣單胞菌(Aeromonas.media)［10］、海弧菌生物變種Ⅰ(Vibrio.pelagius biovarI)等均可引發(fā)該病，而病毒也可能引發(fā)該病。Huan Deng等［11］從患病刺參表皮和腸道分離的細(xì)菌均導(dǎo)致不同程度死亡率，認(rèn)為腐皮綜合癥是由多種不同細(xì)菌引起的。刺參為沉積食性，主要靠楣?fàn)钣|手扒取底質(zhì)表面的沉積物為食，刺參超過(guò)70%的能量需求來(lái)自于細(xì)菌。這些細(xì)菌在刺參消化道會(huì)形成相對(duì)穩(wěn)定的群落及優(yōu)勢(shì)菌群，當(dāng)某種細(xì)菌隨著環(huán)境的改變大量繁殖，抑制有益細(xì)菌生長(zhǎng)，成為優(yōu)勢(shì)菌群，就會(huì)導(dǎo)致刺參抵抗力下降，誘發(fā)疾病。因此，不同的環(huán)境條件下可能形成不同的致病優(yōu)勢(shì)菌群，導(dǎo)致刺參暴發(fā)“腐皮綜合癥”。

通過(guò)微生物分析和人工回接感染試驗(yàn)證實(shí)，優(yōu)勢(shì)菌LNUB415可能是大連海域刺參“腐皮綜合癥”重要病原菌之一。采用形態(tài)學(xué)、生理生化測(cè)定以及16S rDNA序列分析等方法對(duì)其進(jìn)行了分類學(xué)鑒定，初步確定LNUB415為蠟樣芽胞桿菌。蠟樣芽胞桿菌為革蘭陽(yáng)性好氧桿菌，是我國(guó)正式批準(zhǔn)生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種之一，常作為陸生畜禽微生態(tài)制劑的益生菌種。但蠟樣芽胞桿菌中的部分菌株具有致病性，能引起敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺部感染等疾病，由蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒事件也屢見(jiàn)報(bào)道。洛藝文等［12］也發(fā)現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌能夠?qū)е麓虆⒏ぞC合癥的發(fā)生，可能由于皮下注射量不同，本實(shí)驗(yàn)具有較高的致死率，但發(fā)病癥狀基本相同。本實(shí)驗(yàn)中，隨著菌懸液濃度增加，致死率也增加，說(shuō)明該菌達(dá)到一定濃度，對(duì)刺參具有很大的危害性。對(duì)該菌進(jìn)行加熱預(yù)處理(A4組)，仍具有較高的致死率，但發(fā)病潛伏期較長(zhǎng)，可能是該菌的芽胞耐高溫沒(méi)有完全殺死或菌體蛋白有致病性，具體致病機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)慎用含蠟樣芽胞桿菌的微生態(tài)制劑，使用前應(yīng)首先確定菌株的安全性。除刺參外，蠟樣芽胞桿菌對(duì)其他海水養(yǎng)殖種類的危害性，需進(jìn)一步研究。

中草藥制劑在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用仍屬于起步階段，孟慶大等［13］將當(dāng)歸、刺五加等復(fù)方中草藥喂養(yǎng)患病刺參，有效地降低了死亡率。王印庚等［14］對(duì)刺參“腐皮綜合癥”病原菌進(jìn)行24種中草藥的體外抑菌試驗(yàn)，以期篩選高效專用中草藥。黃連作為中醫(yī)臨床上常用的抗菌消炎藥，其中含有的小檗堿、藥根堿、黃連堿和巴馬亭等主要生物堿成分，具有很高的抑菌活性。本研究將黃連混合餌料喂養(yǎng)患病刺參(B3組)，死亡率降至30%，對(duì)該病起到有效治療。選用諾氟沙星混合飼料喂養(yǎng)患病刺參(B4組)，死亡率降低至20%，雖然死亡率低于中草藥，但抗生素在使用過(guò)程易產(chǎn)生耐藥菌株，并且對(duì)環(huán)境造成危害，容易在生物體內(nèi)蓄積，威脅人類健康，并且有些抗生素能直接或間接造成動(dòng)物機(jī)體免疫力下降，增加發(fā)病率。有報(bào)道，飼料中添加中草藥能明顯提高水產(chǎn)品非特異性免疫功能，增強(qiáng)對(duì)疾病的預(yù)防能力。中草藥以其無(wú)抗藥性、無(wú)殘留、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)逐步應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，陳孝煊等［15］將1%的大黃和黃連拌餌投喂克氏原螫蝦和紅螫螫蝦，發(fā)現(xiàn)這2種中藥能夠增強(qiáng)兩種螯蝦血細(xì)胞的吞噬活性，并增強(qiáng)其非特異性免疫功能。建議在刺參養(yǎng)殖和疾病防治中選擇中草藥替代抗生素。

刺參“腐皮綜合癥”發(fā)病急、病程短、死亡率高，一旦發(fā)病，用抗生素治療效果不理想，容易產(chǎn)生抗藥性和藥物殘留，所以預(yù)防是防制該病的主要措施之一。建議刺參疾病的防治首先應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)控養(yǎng)殖系統(tǒng)的菌群系統(tǒng)，定期投放有效微生物(EM菌)凈化水體，杜絕養(yǎng)殖系統(tǒng)的病原菌感染。另外在刺參日常喂養(yǎng)中適當(dāng)配合中草藥免疫增強(qiáng)劑，提高刺參自身機(jī)體免疫力，促進(jìn)刺參健康生長(zhǎng)。疾病爆發(fā)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格篩選具有針對(duì)性的藥物，防治濫用抗生素，產(chǎn)生耐藥菌株，并且在使用藥物前應(yīng)進(jìn)行代謝和殘留消除實(shí)驗(yàn)，確定休藥期，提高刺參質(zhì)量安全，促進(jìn)刺參養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

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