人免疫球蛋白重鏈可變區基因引物設計方法的改良

姜晶，孫穎，劉紅艷，牟玲，羅恩杰*

(1.中國醫科大學病原生物學教研室，遼寧沈陽110001，2.沈陽市傳染病院腎綜合征出血熱研究所，遼寧沈陽110006)

基因工程抗體具有分子量小、組織穿透力強、體內清除快、免疫原性低、易于原核表達大量生產和進行基因工程改進等優點［1］。基因工程抗體的構建關鍵是抗體可變區(V)基因的獲得［2］。自Orlandi等［3］最早進行抗體V基因擴增以來，20多年來V基因擴增仍然是一個熱點課題，倍受科研工作者的重視。這是由于從雜交瘤細胞或外周血單核細胞中擴增抗體可變區，是構建ScFv［4］、克隆單克隆抗體和研究抗原與抗體相互作用的關鍵步驟。而抗體可變區的高度變異性使擴增相對困難，至今仍是一個難點。其中，PCR引物的設計對于能否順利擴增抗體基因起關鍵作用。在引物設計時應盡可能保持親本抗體可變區序列的完整性和真實性，盡管抗體分子可變區有著數量巨大的多樣性，但其骨架區、前導區和恒定區相對保守。目前，包含抗體胚系(germ line)基因序列的數據庫主要有Vbase2、IMGT和IgBLAST數據庫。隨著人類抗體胚系基因序列的測序完成，人們對抗體結構的認識更深入了一步，使得對人抗體基因的操作更加簡單易行，使PCR擴增人全部可變區基因成為可能。本研究通過一個開放的簡并引物設計平臺iCODEHOP［5］，針對可變區基因框架區FR1和FR4自主設計一套新的重鏈可變區引物，為獲得新型基因工程抗體及構建噬菌體抗體庫奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數據庫、生物信息學軟件人免疫球蛋白對應的V、J胚系基因序列來自國際免疫遺傳學信息數據庫(IMGT)(http://www.imgt.org/)和IgBLAST數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ig blast)。開放的簡并引物設計平臺iCODEHOP(https://icodehop.cphi.washington.edu/i-codehop-context/Welcome)。

1.1.2 質粒、菌株、工具酶及試劑PMD18-T載體購自TAKARA公司，大腸埃希菌E.coli TG1由本實驗室保存;DNA Marker DL2000、RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(RNA PCR Kit(AMV)Version 3.0)等均購自TAKARA公司;小量質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、Taq酶購自天根生化科技有限公司;淋巴細胞分離液購自鼎國生物制品有限公司;PAGE級引物由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析首先，從IMGT和Ig-BLAST數據庫獲得了全部胚系基因序列，其中包含功能性基因及假基因。由于假基因序列的不完整性和復雜性，在引物設計時必須去除假基因，只覆蓋所有的功能性基因。根據編碼VH基因FR1的胚系基因V片段基因家族的不同分成7組。然后通過BlockMaker服務器將同一家族內的序列進行比對，找出高度保守區域。編碼VH基因FR4的胚系基因J片段共有13個核苷酸序列放在一組中自行找出保守區。

1.2.2 CODEHOP引物設計CODEHOP引物是由簡并的核心區和非簡并的夾板區組成。核心區位于引物的3'端，是通過多序列比對獲得的高度保守區的3～4個氨基酸對應的所有可能的密碼子集合。夾板區位于引物的5'端，是由緊鄰高度保守區的氨基酸序列決定的，主要根據人胚系基因的序列比對后的常用密碼子設計，這個區域的長度通常是15～20個堿基，可以根據用戶需要自行調整。在通過BlockMaker服務器獲得的高度保守區域中使用iCODEHOP系統軟件的默認參數設計可變區引物。反向引物是通過13個J片段核苷酸序列手動設計。

1.2.3 VH基因的擴增①cDNA合成:取未經免疫的健康人外周血5 mL，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。參照RNA提取試劑盒使用說明，提取總RNA。按照TAKARA RNA PCR Kit(AMV)Version 3.0說明進行第一鏈反轉錄合成得到cDNA;②PCR擴增VH基因:以cDNA為模板應用自主設計的CODEHOP引物擴增抗體重鏈可變區基因。反應體系50 μL;反應條件:94℃5 min;94℃30 s、55℃30 s、72℃1 min;共進行35個循環，72℃延伸10 min。取5 μL PCR產物于1%凝膠中電泳，電壓80 V，30 min后用凝膠成像系統進行掃描;③VH基因的鑒定:PCR產物純化后連入PMD18-T載體中，對多個單克隆進行測序鑒定。

2 結果與分析

2.1 引物設計

通過iCODEHOP設計簡并引物共獲得5'端引物7條。根據13條胚系基因J區的核苷酸序列手動設計獲得3'引物1條，分別與7條5'端引物配對使用(表1)。這套引物可以擴增人免疫球蛋白重鏈可變區框架區1(FR1)至框架區4(FR4)(圖1)。

2.2 VH基因的擴增

應用自主設計的引物，經RT-PCR擴增獲得VH基因。如圖所示，每對引物擴增的基因大小都與預期一致，大小約為350 bp(圖2)。

表1 擴增人免疫球蛋白重鏈可變區基因的引物Table 1 Primers for PCR amplification of Ig VH genes

2.3 VH基因多樣性分析

為了鑒定PCR產物的特異性和多樣性，將PCR產物純化，克隆入PMD18-T載體中，轉化TG1菌，多個單克隆提取后測序，與GenBank和IMGT/V-QUEST數據庫比對表明，序列分析均為人Ig重鏈可變區基因，包含4個FR區和3個CDR區，V、D、J 3個基因經重排后相互連接在一起，形成V-D-J復合體，完成重鏈重排。對編碼VH基因序列的胚系基因來源進行了分析，顯示了其多樣性(表2)。

表2 重鏈可變區基因的多樣性分析Table 2 Ig VH gene diversity analysis

3 討論

隨著人類抗體胚系基因序列的測序完成，編碼重鏈可變區基因的V、D、J基因片段可從IMGT數據庫中獲得，使PCR擴增人全部可變區基因成為了可能。為了有效地擴增人Ig可變區基因，首先設計引物時應考慮的原則就是不影響產物多樣性的前提下減少引物的數量。本研究通過選擇不同胚系基因家族內的高度保守區來達到這一目的。

為了獲取抗體基因，通常有3種設計思路:①在框架區FRl和FR4設計引物，可直接獲得V基因;②設計套式PCR引物，先在信號肽和C區設計引物，再在FR1和FR4區設計引物，可提高引物的特異性并獲得完全真實的V區序列，但信號肽序列變化較大，不易設計;③5'-RACE或3'-RACE，設計的引物可針對C區或polyA區，用此方法也可獲得完全真實的V區序列，而且不易漏過可用的抗體基因，可用于通用引物無法擴增的雜交瘤細胞，但操作比較繁瑣［6］。本研究在框架區FRl和FR4設計引物，直接獲得了Ig重鏈可變區基因，設計方法簡便有效。

目前有許多公共的開放工具都是根據核苷酸序列為基礎設計簡并引物，然而對于數量較大的基因片段，從氨基酸序列中尋找高度保守區可行性更高。GeneFisher［7］和iCODEHOP都是以氨基酸序列為基礎設計引物，用GeneFisher所設計的引物在任何位點都可以有簡并堿基，在PCR過程每一循環中都不能與模板完全匹配。而用iCODEHOP所設計的引物包括兩部分，一部分是長度為11～12個堿基的3'簡并核心區，一部分是根據保守氨基酸和密碼子偏好性原則設計的5'非簡并夾板區。用iCODEHOP引物擴增時，在第1個循環只有1種組合的特異性引物的3'核心區與目的基因完全匹配，但從第2個循環開始，每一個引物的5'夾板區都與第1輪擴增的模版完全匹配，所以就增加了擴增的特異性、準確性和成功率。

iCODEHOP過去常被用于對未知基因的引物設計，如:不同物種的同源基因、相同基因組的種內同源基因或者不同宿主中的新病原體［8-9］。本研究首次將iCODEHOP用于Ig可變區基因的引物設計。為了驗證引物的特異性，對一些重組的單克隆進行了測序分析。盡管測序的數量不大、每一對引物也不是特異性擴增所屬家族內的序列，但序列分析仍然顯示了基因的多樣性。也即表明了iCODEHOP所設計引物的有效性，為擴增其他物種可變區基因或T細胞受體(TCR)提供了新的設計思路。

［1］ 馬穎.單鏈抗體及其在生物醫學中的應用［J］.免疫學雜志，2006，22(3):1-3.

［2］ Li J，Wang Y，Wang Z，et al.Influences of amino acid sequences in FR1 region on binding activity of the scFv and Fab of an antibody to human gastric cancer cells［J］.Immunol Lett，2000，71(3):157-165.

［3］ Orlandi R，Gussow PT，Jones.Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86(10):3833-3837.

［4］ 邵長利，史利軍，章金剛，等.抗人紅細胞H抗原單鏈抗體基因克隆和表達［J］.免疫學雜志，2008，24(2):238-242.

［5］ Boyce R，Chilana P，Rose TM.iCODEHOP:a new interactive program for designing COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers from multiply aligned protein sequences［J］.Nucleic Acids Res，2009，37(Web Server issue):W222-W228.

［6］ Ozawa T，Kishi H，Muraguchi A.Amplification and analysis of cDNA generated from a single cell by 5'-RACE:application to isolation of antibody heavy and light chain variable gene sequences from single B cells［J］.BioTechniques，2006，40(4):469-478.

［7］ Lamprecht AL，Margaria T，Giegerich R，et al.GeneFisher-P:variations of Gene-Fisher as processes in Bio-jETI［J］.BMC Bioinformatics，2008，9(Suppl.4):S13.

［8］ Staheli JP，Boyce R，Rose TM，et al.CODEHOP PCR and CODEHOP PCR primer design［J］.Methods Mol Biol，2011，687:57-73.

［9］ Staheli JP，Ryan JT，Rose TM.Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers(CODEHOPs)for the detection of novel viruses in non-human primates［J］.Methods，2009，49(1):32-41.