香菇雜交菌株遼香1號的初步鑒定

張海濤，李莉，陳飛，冀寶營，敖靜，柴林山，郝捷

(1.沈陽農業大學，遼寧沈陽110161;2.遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000)

香菇屬于真菌門，擔子菌綱，傘蘑目，口蘑科，學名Lentinus edodes，是世界上著名的食用菌之一，約占食用菌總產量的15%。其味道鮮美，香味宜人，并具有一定的食療價值，是一種重要的商品菇類［1］。香菇品質的好壞與品種有很大的關系，所以優良品種的選育尤為重要。本實驗以香菇申香4號、L26菌株為親本，利用原生質體單核化技術，采用對稱雜交和非對稱雜交方法進行雜交，通過數年栽培試驗篩選獲得1株高產、高抗、短柄的新菌株—Liao1。形態學鑒定、同工酶實驗、ITS序列分析等是較常見且簡單實用的菌株鑒定方法［2］。本文采用上述方法對香菇菌株Liao1進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源本實驗室雜交選育的菌株Liao1，實驗室保藏香菇菌15株，共16株。

1.1.2 培養基①PDA綜合培養基:土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，維生素B10.04 g;②液體培養基:未加瓊脂的PDA綜合培養基。

1.2 方法

1.2.1 形態學鑒定①子實體形態觀察:通過觀察子實體的菌蓋、鱗片、子實層、菌柄等形態特征對此香菇品種有初步的了解;②菌絲體形態觀察:制作菌絲玻片，于光學顯微鏡下觀察菌絲特征［3］。

1.2.2 菌種活化將分離的菌株及實驗室保藏的菌株在PDA綜合培養基上25℃培養10 d，活化后的菌種直接用于拮抗實驗、粗酶液的提取以及DNA的提取。

1.2.3 拮抗試驗將活化后的菌種用打孔器取菌落邊緣生長旺盛的同齡菌絲體接種于PDA綜合培養基平板上，并做好標記(接種情況:每個平皿接一分離菌株和2個各不相同的實驗室保藏菌株，共計7組，每組做2個重復)。25℃靜置培養，2周后觀察菌株生長交界處的拮抗反應情況。1.2.4同工酶實驗①聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑(汪家政，2002)［4］:A液—丙烯酰胺儲存液(30%(質量體積比)丙烯酰胺，0.8%(質量體積比)雙丙烯酰胺);B液—4×分離膠緩沖液(1.5 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8);C液—4×濃縮膠緩沖液(0.5 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8);AP液—過硫酸銨溶液(1%(質量體積比);電極Buffer—10×(50 mmol/L Tris，284 mmol/L Gly，pH 8.8);提取Buffer—1×(0.125 mmol/L Tris-HCl，20%(質量體積比)甘油，pH 6.0);指示劑—100×(1%(質量體積比)溴酚蘭);②菌絲體培養及粗酶液提取:將菌種活化后接種于液體培養基中，放25℃，170 r/min搖床上震蕩培養1周左右。取培養好的菌絲，用無菌水洗去培養基，用無菌濾紙吸取水分。然后稱取0.3 g放入研缽中，液氮研磨，將研磨產物轉移到1.5 mL的離心管中，加0.6 mL提取緩沖液，混勻，10 000 r/min，4℃離心7 min，上清液即為粗酶液，放入-20℃冰箱保存備用［5］;③電泳:采用垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，1.5 mm凝膠，7.5%分離膠，3%濃縮膠。電極緩沖液pH 8.8，溴酚蘭為指示劑，每孔點樣40 μL，穩流電泳，濃縮膠電流為20 mA，待指示劑進入分離膠，電流變為45 mA，當指示劑距膠板底部1 cm時停止電泳［6］;④染色:α-蔡醋乙酸25 mg，β-蔡醋乙酸25 mg，固蘭RR鹽50 mg，用3 mL丙酮溶解后，加入0.2 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液72 mL，過濾。注意酯酶同工酶染色液要隨用隨配。電泳后將凝膠小心剝離，先用蒸餾水漂洗1次，轉移到染色液中，25℃染色10 min，待條帶清晰顯色后，蒸餾水漂洗幾次，用凝膠成像儀和相機拍照。注意在操作過程中要戴手套，以免污染。

1.2.5 菌株分子鑒定①ITS-5.8S rDNA序列擴增與測序:以SDS法提取菌株DNA，以引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'20 bp)和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'19 bp)進行PCR擴增。PCR反應條件:預變性98℃，5 min;變性95℃，35 s;延伸72℃，40 s;35個循環，最終72℃，充分延伸8 min。由PCR產物電泳結果切割所需DNA目的條帶，交由上海生物工程有限公司完成測序;②系統發育樹的構建:將菌株的ITS-5.8S rDNA測序結果提交GenBank核酸序列數據庫進行BLAST比對，使用Bioedit將與之同源性較高的序列進行Clustalw比對，通過MEGA軟件采用鄰位相鄰法作出系統發育樹［7］。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

2.1.1 子實體形態觀察①菌蓋形態:平面為圓形，側面為圓凸形，縱切面為拱形;直徑7.0 cm左右，上表皮褐色，厚度2 cm左右，肉質肥而厚;②鱗片形態:鱗片分布于菌柄與子實層之間，覆在子實層上;約0.3 cm寬，2.5 cm長，0.08 cm厚，顏色透明;③子實層形態:圓餅狀，棉絮狀排列;寬2.0 cm左右，密度大，乳白色;④菌柄形態:圓柱形(上粗下細)，長4.0 cm左右。菌蓋直徑與菌柄長度比例為325∶100，菌柄粗細為1.5 cm左右;菌蓋直徑與菌柄直徑的比例為43∶10;菌柄表面淺褐色，有毛，以纖維狀肉質為主。Liao1子實體形態如圖1所示。

2.1.2 菌絲體形態觀察活化后的菌株用打孔器打孔接種于PDA綜合培養基中，25℃培養7 d觀察菌落，Liao1菌絲白色絨狀。1 000倍光學顯微鏡下觀察，Liao1菌絲形態見圖2。其菌絲有橫隔，較多分枝，有明顯的索狀聯合結構。

圖1 Liao1子實體形態Fig.1 Fruiting body morphology of Liao1

圖2 顯微鏡下Liao1菌絲形態(1 000×)Fig.2 Hyphal morphology of Liao1 under microscope(1 000×)

2.2 拮抗實驗

拮抗結果見表1，供試菌株拮抗反應見圖3。

表1 供試菌株間的拮抗反應結果Table 1 The results of antagonist reaction between the strains

圖3 供試不同菌株間的拮抗Fig.3 For the antagonism between the different strains tested

由圖3可見，Liao1與L26、087、申香4沒有產生拮抗，親緣關系較近［2］。Chiu(1999)、代江紅(2001)分別在研究野生香菇遺傳多樣性和品種鑒定中使用拮抗試驗，日本的香菇新品種登記制度也把拮抗反應作為一個品種鑒定的重要指標。本實驗證實拮抗反應可以區分一定數量的菌株。

2.3 同工酶實驗

供試菌株的酯酶同工酶圖譜見圖4。

圖4 供試菌株的酯酶同工酶圖譜Fig.4 Ester isoenzyme patterns of the strains tested

表2 供試菌株間酯酶同工酶相對遷移率Table 2 Used in the experiment strains esterase relative transfer rate

表3 保藏菌株與分離菌株的聯合系數(S)Table 3 Preservation strains and separation of the strains of the joint coefficient(S)

從香菇酯酶同工酶電泳結果顯示(圖4、表2)，香菇共出現14條酯酶同工酶條帶，其遷移率(R)均在0.426～0.792之間，除R=0.792的是所有菌株所共有的條帶外，其他13條均為多態性條帶。根據2個菌株之間酯酶同工酶酶譜相似值的估算，可算出2個菌株之間的聯合系數(S)［4］:

供試的13株菌株與Liao1間的聯合系數見表3。S在0～1之間，聯合系數越小說明2菌株間親緣關系越遠;反之，聯合系數越大說明2菌株間親緣關系越近［2］。由表3可以看出Liao1與L26 2菌株間的親緣關系最近(S=0.800);Liao1與L241 2菌株間的親緣關系最遠(S=0.125)。從結果上看，Liao1與親本L26親緣關系最近，但與申香4親緣關系也比較接近(S=0.667)。

2.4 菌株分子鑒定結果

菌株Liao1的ITS-5.8S rDNA序列分析:菌株Liao1的ITS-5.8S rDNA序列測定片段長度為649bp，序列提交GenBank，登錄號為JQ797413。將Liao1菌株的ITS-5.8S rDNA序列在GenBank中進行BLAST比對，結果顯示Liao1的ITS-5.8S rDNA序列與香菇屬的同源性最高，相似性大于99%，利用MEGA5.0的Maximum Likelihood進行系統發育樹的構建，見圖5。從系統發育樹中可以看出菌株Liao1與JQ797416、FJ379267.1聚在同一分支，其置信度為66%，遺傳距離顯示菌株Liao1與JQ797416、FJ379267.1的遺傳距離最近，達到99.8%。遺傳距離顯示Liao1菌株與香菇屬的遺傳距離相近。結合形態觀察，參照《真菌鑒定手冊》，初步確定Liao1菌株屬于Lentinus edodes，但不同于其親本L26及申香4。

圖5 以ITS-5.8S rDNA序列同源性為基礎的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the homology of ITS-5.8S rDNA sequences

3 討論

香菇菌種鑒定方法主要有形態學鑒定、拮抗、同工酶、核糖體DNA、隨機擴增多態性(RAPD)、限制性片段長度多態性(RFLP)、擴增片段長度多態性(AFLP)等。就本實驗而言:①形態學鑒定:形態學特征在真菌分類中占據重要的地位，特別適用于大型真菌類。但是真菌的某些形態特征容易受發育階段和環境因素的影響，如空氣濕度、溫度、通風、培養基種類等因素都有可能影響其子實體的形態特征。因此單純利用形態特征進行真菌菌株分類鑒別容易產生分歧。雖然不能單純用形態學進行品種鑒別，但仍可以作為食用菌品種鑒別的一個指標，用于食用菌品種鑒別的形態特征主要是子實體的形態特征。日本實行的香菇品種登記中把形態特征作為重要的鑒定指標;②拮抗雖被廣泛用于香菇的品種鑒定，但對于遺傳關系比較近的菌株來說，拮抗的分辨率不如DNA指紋圖譜高，一般在品種鑒定中和DNA指紋圖譜結合使用。如本實驗中Liao1與其親本L26和申香4號就無拮抗反應;③在真菌的生化標記中，酯酶同工酶的穩定性最好，是目前菌種鑒定的常用方法。同工酶技術也有缺點，實驗材料的采集時間、采集部位和實驗材料的培養條件都可能對同工酶譜產生影響(Micales，1986)［8］。故實驗條件保持一致性很重要;④分子生物學方法能直接從DNA序列水平上反映真菌的遺傳關系，較形態學和生理生化指標更客觀準確，并且操作簡單，準確性可靠，特異性高。因此應用分子生物學方法從遺傳進化角度闡明真菌種群之間和種群內的分類關系是目前真菌分類研究的熱點。

通過本實驗可以得出的初步結論為Liao1屬于Lentinus edodes，但有別于其親本申香4號、L26以及其他所供試菌株的，可以初步認定為新菌株。

［1］ Shu-Tibng Chang.Mushroon Biology and Mushroon Products［M］.Chinese University press，1997:1-10.

［2］ 張瑞穎.香菇菌株多相鑒定鑒別技術研究［J］.中國農業大學學報，2004，5:18-23.

［3］ 劉士旺.真菌形態的幾種觀察方法［J］.生物學通報，1998，33(10):45.

［4］ 汪家政，范明.蛋白質技術手冊［J］.北京:科學出版社，2002.

［5］ 張慶華，趙新海，鐘麗娟，等.酯酶同工酶分析鑒別生產用平菇菌種真實性研究［J］.山東農業科學，2009，41(6):10-12，26.

［6］ Toyomasu T，Zenyozi A.同工酶電泳法鑒別香菇菌株(湯衛真譯)［J］.國外食用菌，1985，2:4-6.

［7］ 關艷麗，李莉，陳飛，等.1株產漆酶白腐真菌的篩選和鑒定［J］.微生物學雜志，2010，30(3):74-77.

［8］ 葉明，葉生梅，潘迎捷.香菇雙單雜交后代不同發育階段酯酶同工酶研究［J］.微生物學雜志，2005，25(1):54-56.