酸性半纖維素降解細菌的篩選與鑒定

徐有權，顧文杰，張發寶，徐培智，解開治，王立群*

(1.東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150030;2.廣東省農業科學院土壤肥料研究所，廣東廣州510640)

農作物秸稈是自然界中蘊藏十分豐富的可再生資源，我國每年秸稈產量可達7億多噸［1］。近些年來，科學家們不斷探索有效利用秸稈廢棄物的方式。其中，將秸稈還田或用于堆制肥料，不但充分利用了資源、減少了污染，還能增加土壤有機質，使土壤肥力提高，利于作物生長，因此備受關注。但秸稈直接還田后在土壤中分解轉化的周期長，難以作為當季作物的肥源。而制約秸稈分解的關鍵問題是由于秸稈含有大量難以分解的木質素、纖維素和半纖維素，其中半纖維素占植物干重的35%［2］，在自然界中含量僅次于纖維素。半纖維素通過化學鍵與木質素連接，包裹在纖維之外，將木質素和纖維素緊緊拉在一起，形成難分解的木質纖維素［3］。半纖維素的快速分解是整個秸稈分解進程中至關重要的環節，但目前研究的熱點主要集中在纖維素和木質素降解菌的篩選［4］，而對半纖維素降解菌研究卻較少。本試驗篩選出高效半纖維素降解土著微生物，保證其在土壤中具有較好的定植能力，并且能夠適應我國南方酸性土壤環境，產酶能力穩定。對所篩菌株進行了鑒定以確保菌株的安全性，為半纖維素降解菌在今后的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品采自廣東省增城市周邊水稻土及田間富含腐爛稻稈的泥土。

1.1.2 培養基(g/L)初篩培養基:NH4NO32.0，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl2·2H2O 0.2，K2SO40.1，NaCl 0.2，半纖維素15.0，瓊脂20.0，pH 5.0～6.0，121℃滅菌20 min;牛肉膏蛋白胨培養基:牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 5.0～6.0，121℃滅菌20 min，用于菌種的純化保藏;復篩培養基:K2HPO41.0，KH2PO41.0，NH4NO32.0，MgSO4·7H2O 0.2，酵母膏5.0，半纖維素20.0，pH 5.0～6.0，121℃滅菌20 min，倒雙層平板，下層為2%水瓊脂;液體發酵培養基:成分同復篩培養基，去除瓊脂即可。

1.1.3 主要儀器與試劑冷凍恒溫振蕩器(太倉市實驗設備廠);臺式高速冷凍離心機(Sigma);電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司);7200型可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司);人工氣候箱(寧波江南儀器廠);PCR儀(BIO-RAD);凝膠成像儀(BIO-RAD)。Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR和16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit購自TaKaRa公司。Tris，Na2EDTA·2H2O，瓊脂糖及其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 半纖維素的制備將脫粒后的稻稈烘干，粉碎后加5倍體積水浸泡，135℃蒸煮0.5 h預處理，洗去灰分并破壞半纖維素-木質素復合結構［5］。過濾得濾渣，加10%NaOH(固液比為1 g∶15 mL)90℃處理2 h。冷卻后離心得濾液，用濃鹽酸調pH 4.5～5.0。加入與濾液等體積的95%乙醇沉淀半纖維素，離心收集沉淀，用無水乙醇洗滌2次，60℃烘干，研磨后過80目篩［6］。

1.2.2 菌種的初篩稱取10 g樣品加入含90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，200 r/min振蕩30 min后逐級稀釋，取稀釋度為104～106倍樣品0.1 mL涂布初篩培養基平板，30℃恒溫箱中倒置培養。挑取初篩平板上具有水解圈的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上分離、純化。

1.2.3 菌種的復篩將初篩菌株點種于復篩培養基平板，每株點3個重復，以未點菌平板為對照，30℃培養，72 h后測量水解圈的直徑D(mm)及菌落的直徑d(mm)，并計算D/d值。將復篩菌株在牛肉膏蛋白胨斜面上連續傳代7次(每代間隔7 d)，測量各代水解圈直徑D與菌落直徑d，選擇D/d無明顯變化的菌株接入液體發酵培養基測定半纖維素酶活力。

1.2.4 半纖維素酶活力測定刮取斜面菌種接入液體牛肉膏蛋白胨培養基，30℃、180 r/min振蕩培養24 h，轉接種子于含100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，接種量5%，同樣條件下發酵培養。發酵液經離心(5 000 r/min，10 min)、過濾后液體即為待測酶液。移取酶液0.5 mL于20 mL刻度試管，加入pH 5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.0 mL和1%半纖維素底物0.5 mL，50℃水浴中保溫10 min，取出立即按DNS法測定還原糖含量，以煮沸酶液為對照［2］。半纖維素酶活力(U/mL):在1 min內水解半纖維素底物，產生1 μg木糖的酶量為1個酶活力單位(U)。酶活的計算公式如下:

X:半纖維素酶活力，U/mL;A:根據吸光度在標準曲線上查得的木糖生成量，μg;N:樣品的稀釋倍數;0.5:參與反應的酶量，mL;10:反應時間，min。

1.2.5 菌種鑒定①培養特征及生理生化試驗參照伯杰氏手冊和常見細菌系統鑒定手冊［7-8］;②

16S rDNA序列測定與系統發育分析［9］:平板劃線得到待測菌單菌落，用滅菌槍頭挑取適量菌體，置于含有50 μL裂解液的滅菌EP管中。80℃熱變性15 min，低速離心，取5 μL上清液做為PCR反應模板。用試劑盒擴增基因組DNA。50 μL反應體系:模板DNA 5 μL，PCR Premix 25 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer2 0.5 μL，dH2O補足至50 μL。PCR反應條件:94℃5 min;94℃1 min，50℃1 min，72℃2 min，30個循環;72℃5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物純化及測序由寶生物工程(大連)有限公司完成。將測序結果提交至NCBI核酸數據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中進行序列比對，獲得相關序列，利用ClustalX(Version 2.1)軟件進行多序列匹配排列，以MEGA5.05軟件計算進化距離，用Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

培養2 d即可在初篩平板上看到菌落，并且部分菌落周圍有水解圈出現。隨著菌體的生長，一些開始沒有產生水解圈的菌落周圍也出現水解圈，通過初篩共有16株細菌可在以半纖維素為唯一碳源的初篩培養基上產生水解圈，命名為NB1～NB16。將它們點接到復篩培養基，結果表明:16株菌產生水解圈的早晚、大小及清晰度各不相同。NB13和NB16點種未產生水解圈，NB14和NB15水解圈微弱無法測量，點種結果詳見表1。對復篩菌種進行傳代，淘汰不再生長和生長緩慢的菌株，最終選擇D/d值無明顯變化且比值較高的4株菌測定酶活。

表1 水解圈測定結果Table 1 The diameter of hydrolyzed circle of different strains

2.2 半纖維素酶活力測定

所篩菌株的半纖維素酶活測定結果見圖1。由圖1可知，各菌株除NB6只有在第168 h酶活略有升高外，其余菌株均出現2個高峰。NB9在第48 h達到1個小高峰，酶活為51.12 U/mL;NB8和NB10第1個峰值分別在第72 h和第96 h，酶活為85.12 U/mL和84.57 U/mL。各菌株的第2個產酶高峰均為第168 h，其中NB8的酶活為105.73 U/mL，明顯高于其他菌株，差異極顯著(P＜0.01)。因此，從產酶時間和酶活兩方面綜合考慮，最終確定菌株NB8為進一步研究對象。

圖1 半纖維素酶活力變化曲線Fig.1 Activition curve of hemicellulase

2.3 菌種鑒定

2.3.1 培養及形態學特征菌株NB8在液體培養基表面形成網狀菌膜。在牛肉膏蛋白胨培養基上菌落形態為乳白色不透明、圓形凸起、邊緣整齊、表面褶皺、較濕潤。染色結果為革蘭陽性、桿狀、端生或側生鞭毛1至數根、無莢膜。

2.3.2 生理生化測定結果菌株NB8的主要生理生化指標見表2。

表2 生理生化實驗結果Table 2 The physiological and biochemical characteristics

根據測得結果查閱菌種鑒定手冊，結合以上培養及形態特征可以判斷該菌與芽胞桿菌屬最為相近。

2.3.3 16S rDNA序列分析PCR產物測序后得到1 495 bp大小堿基序列。將測得序列提交至NCBI網站進行序列比對(收錄號:JQ038150)，與NB8同源性較高的均為芽胞桿菌屬，選取典型菌株，用ClustalX軟件進行多序列匹配，以MEGA 5.05軟件計算進化距離并構建系統發育樹(圖2)。從圖中可以看到NB8與Bacillus pumilus聚于同一分支，親緣關系最近。綜合以上形態及生理生化特征，可以初步確定NB8為短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)。

圖2 菌株NB8的16S rDNA序列系統發育樹Fig.2 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain NB8

3 討論

從特定環境中篩選到的菌株，往往具有適合在這種環境中生存的能力。從水稻田及周邊腐爛稻稈中篩選的菌株，來源于田間，理論上認為它們更適合作為發酵菌劑用于秸稈還田。

在菌株篩選中，有些菌株雖然初篩時水解圈較大或D/d值較高，然而經過傳代后卻表現出不同程度的退化。D/d值最大的NB7在連續傳代后幾乎不再生長，NB1、NB2和NB3也出現相同現象。而后將降解效果較穩定的菌株進行酶活測定，從產酶時間及酶活高低等方面綜合考慮，NB8效果最好，但NB8在復篩培養基上測得的D/d值卻并非最高。這說明，對于高效半纖維素降解菌的篩選要綜合水解圈大小、D/d值、傳代穩定性、產酶時間以及酶活力等多方面的數據進行考慮。

從酶活測定結果可以看出，216 h里出現2次產酶高峰，這與孫迅等［6］研究結果相似。并且第2次酶活明顯高于第1次，總體呈上升趨勢。分析其原因，一方面半纖維素酶為誘導酶，在本實驗中可能誘導產生了2種主要半纖維素酶組分，一種酶先作用于半纖維素高級結構，暴露出部分亞基后誘導另一種酶的合成。另一方面，可能與菌株的產酶周期有關，在底物誘導下產生相應的酶分解底物生成小分子的產物，產物積累到一定量后反過來抑制酶的合成，關于酶的產生及作用機制的研究還有待進一步深入。

本試驗中篩選的菌株經生理生化和分子生物學方法鑒定為短小芽胞桿菌，該菌種可用于農業生產中，安全可靠，72 h半纖維素酶活可達85.12 U/mL，這要高于孫迅等［6］在pH 6.5～8.5篩得短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)H-101半纖維素酶活(47.20 U/mL)和秦玉花［5］篩選的短小芽胞桿菌(B.pumilus)L2-19木聚糖酶活(1.68 U/mL)。慕娟等［10］篩選的短小芽胞桿菌(B.pumilus)M-26木聚糖酶最適作用pH為8.0，酶活為620 IU/mL。以上所篩選得到的芽胞桿菌均在中性偏堿條件下產酶活性較高。而本試驗是在pH 5.0～6.0條件下篩選半纖維素分解菌，與同樣是酸性條件下篩選的菌株相比也具有較高的酶活力。秦玉花［5］篩選的枯草芽胞桿菌(B.sublitis)Y25最適反應pH為6.0，酶活為1.87 U/mL。陳叢瑾［11］分離的1株木聚糖酶產生菌，初始pH為5.0時，木聚糖酶活為13.68 U/mL。

本試驗篩選的具有高效降解半纖維素能力的細菌，其在酸性環境中生長狀態良好，酶活較高，

后續應對其產酶條件進一步研究，尋找其最適的產酶條件，進一步提高其產酶能力。另外，半纖維素降解菌降解半纖維素的能力不能簡單通過實驗室測定D/d值和酶活加以反映，而是需要結合對秸稈的實際降解效果來綜合評定。

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