微小毛霉凝乳酶的分離純化研究

高維東，宋禮，紀銀莉，何瀟，張玉平，甘伯中

(1.甘肅華羚生物技術研究中心，甘肅蘭州730000;2.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070)

凝乳酶是生產奶酪及凝乳酶干酪素中使牛乳凝固的關鍵性酶，它是一種天冬氨酸蛋白酶，其主要的生物學功能是限制性剪切酪蛋白Phe105～Met106之間的肽鍵，從而導致牛奶的凝結，因此被廣泛應用于奶酪制造業和干酪素產業［1］。凝乳酶來源廣泛，在動植物以及微生物中都有，傳統的凝乳酶來源于小牛的皺胃，但是隨著世界奶酪產業的不斷壯大，單純靠宰殺大量的小牛獲取凝乳酶顯然與現代工業的發展不相符，植物凝乳酶雖然來源廣泛，但是其蛋白水解力強，并且受時間、地點等的限制難以發展［2-3］，微生物生長周期短，產量大，受氣候、地域、時間限制小，用其生產凝乳酶成本較低，酶提取方便，經濟效益高。微生物凝乳酶從1965年起開始取代小牛皺胃酶制造干酪以來，成功地彌補了小牛凝乳酶短缺的問題［4］，并在奶酪制造業與干酪素產業中得到了廣泛應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑微小毛酶HL-1，中國科學院微生物研究所保藏菌株，經本實驗室紫外線和亞硝基胍誘變篩選得到;脫脂奶粉，完達山乳制品有限公司;標準分子量蛋白，美國Sigma公司;其他生化試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基①斜面培養基:馬鈴薯(去皮切塊)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17.3 g，自來水1 000 mL。將馬鈴薯去皮切塊，加1 000 mL自來水，在電爐上80℃加熱1 h，用紗布過濾，補加自來水至1 000 mL，加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶解，分裝，121℃高壓滅菌20 min待用［5］;②液體種子培養基:麩皮水解液30 mL，硝酸銨0.5 g，蔗糖1 g，磷酸二氫鉀0.2 g;③三角瓶發酵培養基:粉碎后新鮮麩皮30 g、硝酸銨0.3 g和磷酸氫二鉀0.5 g加入到500 mL三角燒瓶內，按1∶0.8加入自來水，攪拌均勻，在121℃下滅菌25 min待用;④浸提液:0.85%的氯化鈉溶液［6-7］。

1.1.3 主要儀器與設備UV2450紫外可見分光光度計，日本SHIMADZU;BIO-RAD垂直板電泳儀，美國BIO-RAD公司;恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司;高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司;超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司;超濾儀，美國Millipore公司;真空冷凍干燥機，長沙湘儀離心機儀器設備有限公司;純水機，重慶力德高端水處理設備有限公司;蛋白質層析系統AKTA purifier，美國GE醫療集團公司。

1.2 方法

1.2.1 凝乳酶活力的測定方法Arima方法:用0.01 mol/L的氯化鈣液配制10%脫脂奶粉液，此溶液配制后在室溫放置40 min以上使用，當天使用有效，不宜冰箱放置［8］。取5 mL 10%的脫脂奶粉液在35℃保溫10 min，加0.5 mL適當稀釋的酶液(35℃保溫)，立即搖勻，開始計時(凝乳時間控制在40～90 s)，并把試管傾斜45°以上。在水浴中震蕩試管，觀察壁上出現小顆粒為終點，記錄凝乳時間。在上述條件下，40 min凝1 mL 10%脫脂奶粉的酶量定義為一個Soxhlet單位(SU)［9］。

式中:2 400為40 min的凝乳時間，s;D為酶液稀釋倍數;t為反應時間。

1.2.2 凝乳酶制劑的制備方法將配置好的發酵培養基按14%接種，28℃下發酵72 h后待用。

1.2.3 浸提溫度對酶提取的影響分別在20、25、30、35、40、45℃下將發酵完全的培養基加入0.85%氯化鈉溶液里浸提12 h，除去固體物后測定凝乳酶活力。每個樣做3個平行試驗，取平均值做結果分析。

1.2.4 浸提時間對酶提取的影響30℃下在浸提罐中加入0.85%氯化鈉溶液，分別浸提2、4、6、8、10、12、14 h，除去固形物測定凝乳酶的活力。每個樣做3個平行試驗，取平均值做結果分析。

1.2.5 浸提液pH對酶提取的影響將0.85%氯化鈉溶液的pH分別調整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在不同pH條件下浸提培養物10 h，除去固形物測定凝乳酶活力。每個樣做3個平行試驗，取平均值做結果分析。

1.2.6 浸提液離子強度對酶提取的影響調整浸提液氯化鈉的濃度，分別配制濃度為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的氯化鈉浸提液，浸提10 h，除去固形物測定凝乳酶活力。每個樣做3個平行試驗，取平均值做結果分析。

1.2.7 浸提液加入比例對酶提取的影響分別按物料與浸提液質量比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7加入浸提液，在30℃下提取10 h，除去固形物測定凝乳酶活力。每個樣做3個平行試驗，取平均值做結果分析。

1.2.8 離心沉降對酶活力的影響浸提物以200目的濾布除去固形物，得到的粗酶液分別在6 000、8 000、10 000、12 000、14 000 r/min下離心10 min，測定離心后的上清液凝乳酶活力。每個樣做3個平行試驗，取平均值做結果分析。

1.2.9 膜法對凝乳酶的純化離心后的粗酶液利用微濾及濃縮技術，經過1 μm熔噴濾芯、1 μm PP折疊濾芯、0.2 μm PES折疊濾芯、0.45 μm PES折疊濾芯和0.45 μm PP折疊濾芯等5步過濾，除去發酵液中的培養基雜質、菌絲體、菌體和部分大分子雜蛋白，實現了酶液的澄清，再經過8 000分子量的超濾膜除去大量的水分，實現酶液的濃縮，測定酶活。

1.2.10 有機溶劑沉淀法對凝乳酶的純化離心后的粗酶液加乙醇(95%)，其比值為1∶0.6(體積比)，靜置4 h，離心取上清液加乙醇(95%)，其比值為1∶0.8(體積比)，靜置過夜，離心，沉淀用10倍體積pH 5.0的0.05 mol/L醋酸緩沖液溶解，測定酶活。

1.2.11 層析法對凝乳酶的純化利用美國通用醫療集團的AKTAprocess蛋白質層析儀，用S300和G100的填料進行微小毛霉凝乳酶蛋白的分離純化，實現了凝乳酶蛋白的自動化分離純化，分部收集，測定收集液酶活。

2 結果與分析

2.1 浸提溫度對酶提取的影響

由圖1可以看出，30℃浸提活力最高，酶活為5 450 U/mL。溫度過低，不利于酶從菌絲體及培養物基質中釋放出來，溫度過高會對酶蛋白的熱穩定性造成影響，同時易被微生物降解利用。

圖1 浸提溫度對酶提取的影響Fig.1 Effects of reaction temperature on enzyme extraction

2.2 浸提時間對酶提取的影響

由圖2可以看出，浸提10 h，浸提液凝乳酶活力較高，酶活為4 870 U/mL。隨著浸提時間的延長，凝乳酶逐漸釋放到浸提液中，但由于酶蛋白的穩定性及微生物的降解作用，活力從10 h后逐漸降低。

圖2 浸提時間對酶提取的影響Fig.2 Effects of time on enzyme extraction

2.3 浸提液pH對酶提取的影響

由圖3可以看出，當浸提液的pH值在6.5時，凝乳酶有較高的回收率，酶活為4 120 U/mL。微小毛酶凝乳酶的最適pH值為5.8左右，所以在酸性條件下浸提，更有利于微小毛霉凝乳酶的釋放。

圖3 浸提液pH值對酶提取的影響Fig.3 Effects of pH on the enzyme extraction

2.4 浸提液離子強度對酶提取的影響

由圖4可以看出，1%的氯化鈉有利于凝乳酶的提取，酶活為5 570 U/mL。當氯化鈉濃度過高或過低時，會偏離菌絲體的等滲點，阻礙凝乳酶的釋放。

2.5 浸提液加入比例對酶提取的影響

由圖5可以看出，1∶5的固液比有利于凝乳酶的提取，酶活為4 730 U/mL。固液比太低，不利于凝乳酶從菌絲體及基質中釋放;固液比過高，酶濃度會降低造成酶活的降低，同時間接對后期酶的提取濃縮增加生產成本。

圖4 浸提液離子強度對酶提取的影響Fig.4 Effects of ion concentration on the enzyme extraction

圖5 固液比對酶提取的影響Fig.5 Effects of Solid-liquid ratio on the enzyme extraction

2.6 離心力對酶活力的影響

圖6 離心力對酶提取的影響Fig.6 Effects of Centrifugal force on the enzyme extraction

由圖6可以看出，10 000 r/min離心10 min凝乳酶的回收率最高，酶活為5 720 U/mL。離心力較低，雜質及雜蛋白去除不完全，酶活較低。離心力過高，會造成部分酶蛋白的沉淀及損傷，酶活也不高。

2.7 膜法對凝乳酶的純化

經過5次過濾，1次濃縮后，凝乳酶樣品濃縮8倍，活力提高約6倍，酶活為34 227 U/mL。由于除去了部分雜蛋白、小分子糖類、無機鹽及水，酶液酶活極大提高，但酶液通過濾芯和濾膜時，酶蛋白會有部分損傷，酶活提高倍數和濃縮倍數無明顯的對應關系。同時試驗中也發現濃縮倍數越高，酶蛋白損傷也就越大。試驗中減少膜超濾時間，降低濃縮倍數，采用5倍濃縮粗酶液，酶活約提高了4.5倍，酶活為25 765 U/mL。

2.8 有機溶劑沉淀法對凝乳酶的純化

經過有機溶劑浸提后，樣品濃縮50倍，活力提高約17倍，酶活為97 543 U/mL。通過沉淀法得到凝乳酶溶液，濃縮倍數及酶活比膜過濾法純化凝乳酶都有所提高，但從濃縮倍數及活力提高倍數對應關系可以看到，有機溶劑沉淀法對酶活損失也較大。由于有機溶劑的使用量大，在后期工業化應用中，有機溶劑的回收及安全使用必成為工業化推廣著重考慮的問題。

2.9 層析法對凝乳酶的分離提純

圖7 層析法對凝乳酶的分離提純Fig.7 Chromatography for separation and purification of chymosin

利用AKTAprocess蛋白質層析儀層析樣品后，由圖7可以看出，凝乳酶的保留時間在110～130 min之間，分離純化后，凝乳酶蛋白純度達到95%以上，收集酶液酶活為52 786 U/mL。利用層析法獲得了較純的凝乳酶，粗酶液濃縮了15倍，凝乳酶酶活提高約10倍，酶活損失最小。與膜法對凝乳酶純化相比，層析對凝乳酶的純化效果較好，但層析處理量小，填料昂貴，不適合工業化推廣。

3 討論

試驗結果表明微小毛霉(HL-1)凝乳酶的最適提取條件:浸提溫度30℃;浸提液pH 6.5;浸提時間10 h;浸提液氯化鈉濃度1%;物料與浸提液比例為1∶5;在10 000 r/min下離心10 min，粗酶液提取效果最好。95%的乙醇沉淀純化凝乳酶，濃縮倍數及酶活提高倍數較好，但工業化推廣中乙醇的安全使用及回收成本較高。層析純化凝乳酶，酶活損失最小，純化效果最好，但填料昂貴，處理量小，不適合工業化推廣。膜法純化凝乳酶，通過控制膜處理時間，降低濃縮倍數，酶活損失可以降到最小，適合工業化推廣。

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