丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因表達載體的構建

辛亮，秦銳，宋剛，由田，平文祥，葛菁萍

(黑龍江大學生命科學學院微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱150080)

世界經濟的飛速發展和人口數量的與日俱增給資源帶來了巨大的壓力，特別是以石油為代表的不可再生資源［1］。發展清潔的可再生能源已成為人類必須面對和解決的問題［2-3］。木質纖維素是地球上最豐富的可再生資源，廣泛存在于工農業的廢棄物中［4］。木質纖維素中含有大量的葡萄糖，阿拉伯糖和木糖［5］。以其為原料利用微生物發酵生產清潔可再生的燃料乙醇已經引起人們的高度重視［6］。迄今為止，在自然界中發現近百種能夠利用木質纖維素產乙醇的微生物，但可用以大規模生產乙醇的菌株較少［7］。因此，構建用于乙醇生產的菌株是目前研究的熱點。運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)可以代謝六碳糖產乙醇。它具有強大的將丙酮酸轉化成乙醇的丙酮酸脫羧酶(PDC)和乙醇脫氫酶Ⅱ(ADHⅡ)系統，是迄今為止研究中發現的發酵產乙醇能力最強的細菌。大腸埃希菌(Escherichia coli)發酵底物利用范圍廣泛，可以代謝木質纖維素中的五碳糖，六碳糖和糖醛酸。但由于缺乏將丙酮酸定向轉化成乙醇的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶系統，所以乙醇產量不高［8］。本試驗將運動發酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因(pdc)和乙醇脫氫酶Ⅱ基因(adhB)克隆到pET-28a(+)骨架載體上，構建適合大腸埃希菌的基因表達載體，為能利用木質纖維素分解產物生產燃料乙醇奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒運動發酵單胞菌CICC 10232(Zymomonas mobilis CICC 10232)購自中國工業微生物菌種保藏管理中心、大腸埃希菌DH5α，大腸埃希菌BL21(DE3)均由本實驗室保存。pMD18-T克隆載體購自大連寶生物工程有限公司，pET28a(+)質粒購自Addgene。

1.1.2 培養基①LB(Luria-Bertani)液體培養基(g/L):胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，調pH至7.0，121℃滅菌15 min，用于大腸埃希菌的培養，固體培養基添加2%瓊脂。加入氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB培養基用于篩選重組子;②112#培養基(g/L):酵母膏5，葡萄糖100，硫酸銨1，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5，調pH至7.0，121℃滅菌15 min，用于運動發酵單胞菌的培養;③adhB檢測培養基:LB固體培養基經高壓滅菌后，待溫度降至60℃以下時，加入卡那霉素0.03，IPTG 0.238，95%乙醇0.2%(體積分數)和希夫試劑0.15%(體積分數)，用于定性檢測adhB基因;④pdc檢測培養基:含2葡萄糖的LB固體培養基經高壓滅菌后，待溫度降至60℃以下時，加入卡那霉素0.03，IPTG 0.238和希夫試劑0.15%(體積分數)，用于定性檢測pdc基因。

1.1.3 酶和主要試劑盒EasyPfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司;限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶均購自寶生物工程有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒(產品編號W6511)、膠回收試劑盒(產品編號W5211)、質粒抽提試劑盒(產品編號W5001)購自上海華舜生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 運動發酵單胞菌基因組DNA的提取將保存的Zymomonas mobilis CICC 10232菌株活化后，使用華舜細菌基因組提取試劑盒(W6511)提取基因組DNA，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 引物設計根據GenBank中已登陸的運動發酵單胞菌pdc和adhB基因的全序列并參考文獻［9］，通過比較分析，設計引物pdc-up、pdc-down，adhB-up、adhB-down，用于擴增pdc基因和adhB基因。在adhB-up引物5'端加入核糖體結合位點RBS序列，各限制性內切酶位點為構建元件定向克隆到構建骨架質粒載體pET28a(+)而設計。

表1 引物序列及所加入的酶切位點Table 1 Primer sequences，templates and their restriction endonuclease sites

1.2.3 各構建元件的克隆利用設計的2對引物，按以下各PCR反應程序擴增重組質粒載體構建所需的2個元件片段(表2)。得到的各基因片段與載體pMD18-T連接后轉化E.coli DH5α，經PCR篩選初步鑒定陽性重組質粒，然后進一步經過質粒的提取和雙酶切驗證重組質粒。獲得的重組質粒分別命名為pTQR-P和pTQR-RA。陽性重組質粒的測序由Invitrogen公司完成。

表2 2個克隆元件的PCR反應程序Table 2 The PCR systems used in cloning of two components

1.2.4 高拷貝整合表達載體pQR-PRA的構建將重組質粒pTQR-P和表達載體pET28a(+)用Bam HⅠ和Eco RⅠ進行雙酶切后連接，構建重組表達載體pQR-P。將重組載體pTQR-RA和上步構建表達載體pQR-P用Eco RⅠ和XhoⅠ進行雙酶切后連接，構建重組表達載體pQR-PRA。將以上構建得到的質粒載體轉化大腸埃希菌DH5α，提取質粒pQR-PRA采用酶切和PCR方法鑒定陽性克隆并保存備用。

1.2.5 質粒轉化及酶的檢測提取保存于E.coli DH5α中的pQR-PRA，轉化到E.coli BL21中，用含有卡那霉素的LB平板篩選重組子。首先對陽性重組子進行菌液PCR檢測，然后將其涂布在pdc檢測平板和adhB檢測平板上，進行酶的定性檢測。最后采用SDS-PAGE檢測陽性重組子中酶的誘導表達情況。

2 結果與分析

2.1 運動發酵單胞菌基因組DNA的提取

采用試劑盒提取Zymomonas mobilis基因組DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果見圖1。

2.2 重組T載體的構建

將所得pdc(1 707 bp)、adhB(1 166 bp)基因分別與pMD18-T載體連接后，轉化大腸埃希菌，經PCR鑒定正確，送交公司測序，得到構建成功的2個重組T載體:pQR-P和pQR-RA。將PCR克隆得到的運動發酵單胞菌的pdc和adhB基因序列與GenBank數據庫資料進行比較分析，克隆得到的pdc和adhB基因核苷酸序列與公布的基因序列完全一致。

2.3 高拷貝整合表達載體pQR-PRA的構建

將adhB基因連接至載體pQR-P上。提取質粒pQR-PRA分別用Eco RⅠ和XhoⅠ、Bam HⅠ和Eco RⅠ、Bam HⅠ和XhoⅠ對重組質粒pQRPRA進行酶切和PCR驗證，結果表明所有片段都正確連接至載體上，見圖2。

如圖2所示，分別用Eco RⅠ和XhoⅠ、Bam HⅠ和Eco RⅠ、Bam HⅠ和XhoⅠ對重組質粒pQR-PRA進行酶切。1號泳道產生兩條清晰的條帶，片段大小約為1 166和7 076 bp，分別與adhB基因和質粒pQR-P的大小相符。2號泳道產生2條清晰的條帶，片段大小約為1 707和6 535 bp，分別與pdc基因和pET28a(+)加上adhB基因的片段大小相符。3號泳道產生2條清晰的條帶，片段大小約為5 369和2 873 bp，分別與pET28a(+)載體和pdc基因加上adhB基因的片段大小相符。通過對以上驗證方法的結果進行分析，證明質粒pQR-PRA構建成功，其大小為8 242 bp。

2.4 質粒轉化及酶的檢測

圖3 pdc基因的PCR驗證結果Fig.3 PCR identification of pdc gene

將含Kan的LB平板篩選得到的6個重組菌株QR-PRA1、QR-PRA2、QR-PRA3、QR-PRA4、QRPRA5、QR-PRA6和對照菌株E.coli BL21(DE3)以pdc-up、pdc-down、adhB-up、adhB-down為引物，進行菌液PCR驗證(圖3、4)。

如圖3、4所示，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現篩選到的6個轉化子均擴增出pdc和adhB的特異性條帶，而原始菌株E.coli BL21(DE3)無此條帶，這證明構建的重組質粒pQR-PRA已成功轉入E.coli BL21(DE3)中。將重組菌株QR-PRA1、QR-PRA2、QR-PRA3、QR-PRA4、QR-PRA5、QRPRA6、陰性對照菌株E.coli BL21(DE3)和陽性對照菌株Zymomonas mobilis轉接到pdc檢測指示平板和adhB檢測平板上，37℃培養過夜(圖5、圖6)。

圖4 adhB基因的PCR驗證結果Fig.4 PCR identification of adhB gene

圖5 pdc檢測指示平板Fig.5 Aldehyde indicator plate

如圖5所示，對照菌株E.coli BL21(DE3)的菌落幾乎不顯色，而陽性菌株Zymomonas mobilis和6個重組菌株的菌落顯示紫紅色，說明重組菌株內有丙酮酸脫羧酶產生。

圖6 乙醛指示平板Fig.6 Aldehyde indicator plate

如圖6所示，陰性對照菌株E.coli BL21(DE3)的菌落幾乎不顯色，陽性菌株Zymomonas mobilis和6個重組菌株的菌落顯示紫紅色，說明重組菌株內有乙醇脫氫酶Ⅱ產生。對6個重組菌株進行丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶Ⅱ誘導表達。取6個重組菌株和陰性對照菌株E.coli BL21(DE3)的樣品各20 μL進行SDS-PAGE電泳分析，結果見圖7。

圖7 表達產物的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of expression products

由圖7可見，1～6號泳道上的重組菌株細胞的超聲波破碎裂解物在60和40 ku處全部出現了清晰的條帶，該蛋白質分子量與基因序列推測所得理論分子量一致(丙酮酸脫羧酶分子量約為60 ku，乙醇脫氫酶Ⅱ分子量約為40 ku)。同時，7號泳道上陰性對照菌E.coli BL21(DE3)中沒有這2條條帶，證明丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶Ⅱ在E.coli BL21(DE3)中得到表達。SDS-PAGE結果經Gel-Pro analyzer 4.5軟件分析發現，第3組的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶Ⅱ蛋白表達強度最強，酶活最大，分別為1.17和3.04 U/mg。

3 討論

大腸埃希菌產乙醇量低的兩點主要原因是缺乏將丙酮酸定向轉化成乙醇的丙酮酸脫羧酶(PDC)，以及產乙醇脫氫酶(ADH)的水平很低。因此將PDC和ADHⅡ系統轉入大腸埃希菌中能夠在一定程度上提高乙醇的產量［10］。本文成功構建了將這2個基因轉入大腸埃希菌中的表達載體。

本試驗選擇pET載體為表達載體，E.coli BL21(DE3)為pET載體的宿主菌，其主要有以下幾方面的原因。第一，E.coli BL21(DE3)為DE3的溶原菌。pET載體在DE3溶原菌的宿主菌中表達具有可誘導性。宿主菌形成DE3溶原狀態后，就只有在IPTG誘導的lacUV5啟動子指導T7RNA聚合酶基因轉錄，進而使克隆在pET質粒上的目的基因進行轉錄［11］。所以，可以通過誘導調節降低目的蛋白對宿主的毒性，進而降低質粒的不穩定性。同時，一旦T7RNA聚合酶被充分誘導，幾乎所有細胞資源均用于目的蛋白的合成。第二，pET表達系統中的載體攜帶有融合標簽。融合表達具有多方面的優點:能使外源基因得到有效轉譯，防止包涵體的形成，促進蛋白質的正確折疊以及利于純化［12］。同時，表達的融合蛋白多為天然構象，在一定程度上避免了前人類似試驗中蛋白酶酶解的情況［9］。第三，降低表達蛋白形成包涵體的概率。在某些因素的誘導下，轉化載有目的基因質粒的工程細胞的目的基因高度表達，在胞內易形成包涵體［13］。目前，已有許多研究中將目的基因連入pET載體后在E.coli BL21(DE3)中成功表達［14-17］，這是一個成熟的表達體系。因此，本研究采用了該種表達載體及宿主菌。

mRNA的翻譯起始效率影響克隆的目的基因的表達效率，而核糖體的結合位點又影響mRNA的翻譯起始效率。RBS序列及其與起始密碼子間的間隔長度不合適會導致目的基因表達量偏低［9］。因此，本試驗在設計RBS與起始密碼子之間的距離時，參照了pET28a(+)骨架載體上的RBS與第一個起始密碼子之間核苷酸的長度。在設計引物時，將這部分連接在adhB-up引物的上端。

本試驗初步構建了pdc和adhB基因的表達載體，并已定性檢測，理論上可以使宿主大腸埃希菌高效表達pdc和adhB基因，從而提高乙醇產率，但仍需酶活測定和發酵試驗的進一步確定。

［1］ Randall W.Gentry，Gary S.Sayler，ZHUANG Jie.Towards Sustainable Cellulosic Bioenergy［J］.Journal of Resources and Ecology，2010，1(2):117-122.

［2］ 李夏.論利用玉米秸稈制備生物乙醇技術的現狀［J］.化學工程與裝備，2010，(11):118-119.

［3］ Campbell C J，Laherrere J H.The end of cheap oil［J］.Scientific American，1998，278(3):78-83.

［4］ 王敏，王倩，吳榮榮.木質纖維素生產燃料乙醇預處理技術研究進展［J］.衡水學院學報，2010，12(4):106-109.

［5］ 張穎，馬瑞強，洪浩舟，等.重組運動發酵單胞菌的構建及木糖利用特性研究［J］.生物技術通訊，2009，(7):160-165.

［6］ 趙彩云，王異靜，關東明.纖維素乙醇研究進展［J］.釀酒科技，2009，(10):87-89.

［7］ 李林釗.木糖發酵菌株的篩選及其特性研究［D］.碩士論文，哈爾濱工業大學，2006.

［8］ 張炳照.運動發酵單胞菌發酵條件優化及其PDC基因的原核表達［D］.碩士論文，哈爾濱工業大學，2008.

［9］ 陸堅.運動發酵單胞菌乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫氫酶基因的克隆及在大腸埃希菌中的表達［D］.碩士學位論文，廣西大學，2002.

［10］ Ingram L O，Conway T.Genetic engineering of ethanol production in Escherichia coli［J］.Appl Environ Microbiol，1987，53(10):2420-2425.

［11］ J.Sambrook，D.W.Russell.Molecular Cloning:A Laboratory Manual［M］.3rded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.

［12］ 蘇冬妹.利用融合標簽純化和表達β-甘露聚糖酶［D］.碩士學位論文，黑龍江大學，2007.

［13］ 白東亭，許麗鋒.重組大腸埃希菌的包涵體［J］.中國生物制品學雜志，1996，9(4):188-191.

［14］ 李莉，張芳，羅晨.重組大腸埃希菌BL21-pET28a(+)-ADH誘導表達羰基還原酶的條件優化與應用［J］.藥學與臨床研究，2010，18(2):160-163.

［15］ 郭麗清.PDC基因的克隆與表達及具有升白作用蒎烷類雙苷的研究［D］.碩士學位論文，沈陽藥科大學，2005.

［16］ 李永仙，鄭飛云，李崎，等.重組大腸埃希菌BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl誘導表達β-葡聚糖酶的條件優化［J］.食品與生物技術學報，2009，28(2):250-255.

［17］ 李倩，王夢，劉珞，等.L-乳酸脫氫酶在大腸埃希菌BL-21(DE3)中的表達［J］.生物加工過程，2011，9(6):21-25.