湖南郴州非綜合征型聾患者GJB2、SLC26A4和線粒體DNA12SrRNA基因突變分析△

胡鵬 鄧忠 譚東輝 賴若沙 朱發梅 謝鼎華

耳聾是造成人類殘疾的最常見原因，目前我國有117萬聾兒，其中7歲以下聾兒有80多萬，約60%是遺傳性聾[1]。70%的遺傳性聾是非綜合征型聾，不伴其它器官癥狀。國內大規模耳聾分子流行病學研究表明：縫隙連接蛋白2 (gap junction beta 2, GJB2)、溶質轉運基因家族26類4號(solute carrier family 26 member 4, SLC26A4) 和線粒體DNA12SrRNA基因是最常見的3個非綜合征型耳聾基因[1]。本研究采用耳聾基因芯片聯合DNA測序法對湖南郴州地區154例非綜合征型聾患者實施這3個基因的突變檢測，探討該基因芯片用于臨床的適用性，并分析該地區非綜合征型遺傳性聾的分子流行病學特點。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究調查對象為2010年9月至2011年3月間就讀于湖南郴州聾啞學校的學生及在中南大學湘雅二醫院就診的均診斷為非綜合征型聾的患者154人，均為漢族，男85例，女69例，年齡3～14歲，平均7.8±3.6歲。來自中國郴州地區的154個家庭，在調查前得到患者家屬的正式同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1臨床資料采集 通過患兒家長填寫問卷式調查表獲取患兒的出生史、耳聾發病年齡、家族史、個人史(聾前傳染病史、耳毒性藥物應用情況、頭部外傷史等)、母親孕期情況等。對患者進行全身檢查排除綜合征型聾，同時進行耳科體檢、聽力檢測及耳部影像學檢查等，排除中耳炎和外傷等其他致聾因素。聽力檢測顯示患者均為重度以上(聽力損失大于61 dB)的雙側感音神經性聾。

1.2.2DNA提取 用含EDTA抗凝劑的真空采血管采集受檢者外周血5 ml，應用試劑盒(北京天根生物工程有限公司)提取DNA，提取步驟參照試劑盒提供的使用說明進行。DNA經紫外分光光度計進行定量和純度檢測后，保存于-20 ℃備用。

1.2.3基因芯片檢測 應用耳聾基因芯片(北京博奧生物有限公司)進行遺傳性聾基因突變熱點篩查，按試劑盒說明書進行操作。該芯片可檢測國人中常見的4個耳聾基因中的9個熱點突變，包括GJB2(35delG、176del16bp、235delC及299delAT)、GJB3(538C>T)、SLC26A4 (IVS7- 2A>G及2168A>G)和線粒體DNA12SrRNA(1494C>T及1555A>G)。

1.2.4GJB2基因序列檢測 對基因芯片檢測未發現GJB2基因突變和僅發現單個雜合突變的患者進行GJB2基因的測序。由于GJB2基因的蛋白編碼序列僅存在于第2外顯子上，采用文獻報道的引物進行PCR擴增GJB2基因第2個外顯子[2]，引物由南京金斯瑞生物公司合成。PCR反應體系為50 μl：DNA模板(20 mg/L)4 μl，正反向引物(100 mg/L)各2 μl，2×Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)25 μl，ddH2O加至50 μl。95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環，反應終止后再72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。經電泳檢測產物特異性好的，送南京金斯瑞測序公司純化及測序。

1.2.5SLC26A4基因序列檢測 對基因芯片檢測發現SLC26A4基因的IVS7-2A>G或2168A>G(H723R)突變的患者標本進行SLC26A4基因的測序。SLC26A4基因共21個外顯子，其中開放閱讀框共20個外顯子，不包括第1號外顯子。本研究采用文獻中報道的引物進行PCR擴增及測序[2]，其中7、8外顯子同在一個擴增子內，11、12外顯子在一個擴增子內。共擴增18個片段以覆蓋SLC26A4全部cDNA序列及每個外顯子前后的剪切區序列。采用以下檢測策略：先檢測SLC26A4基因突變熱點區域第7、8號外顯子(擴增子包括第7、8號外顯子以及兩者之間的內含子)，還有第19外顯子以驗證基因芯片的準確性；如果發現純合或復合雜合突變即停止檢測，如果未發現突變或發現單雜合突變則先篩查第3、10、17、15號外顯子，然后檢測剩余外顯子，直至發現另一個突變或檢測完全部外顯子。

PCR反應體系同GJB2基因序列檢測。第7、8外顯子反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環，反應終止后再72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。其它外顯子反應條件同第7、8號外顯子基本一致，只是復性溫度為60 ℃。PCR產物送純化后測序。

1.2.6序列分析 應用DNAStar軟件包中的Seqman軟件進行序列對比分析，將測序結果與Genebank的標準序列進行比對。

1.3統計學方法 采用SPSS 13.0軟件包對基因芯片法和DNA測序法檢測GJB2基因突變的檢出率進行配對卡方檢驗(McNemar檢驗)。

2 結果

2.1基因芯片檢測結果 基因芯片法共檢出26例患者有GJB2基因突變，檢出率為16.88%(26/154)，包括純合突變9例(235delC純合8例，299delAT純合1例)，復合雜合突變10例(235delC+299delAT復合雜合9例，235delC+176del16復合雜合1例)，單純雜合突變7例(235delC雜合3例，299delAT雜合4例)。另外檢出10例(6.49%，10/154)SLC26A4基因突變，包括IVS7-2A>G雜合突變8例，H723R雜合突變2例。還檢出3例患者線粒體DNA12SrRNA基因突變，檢出率為1.95%(3/154)，包括1555A>G突變2例(1.30%)，1494C>T突變1例(0.65%)；這3例患者沒有明確的耳毒性藥物應用史，其中2例有母系遺傳的家族史。所有患者未檢出GJB3基因538C>T突變。

基因芯片法共確診22例，其中，19例為GJB2基因突變導致遺傳性聾(純合突變9例和復合雜合突變10例)，3例為線粒體基因突變導致。SLC26A4基因突變的患者需進一步測序才能確診。

2.2DNA測序結果 對基因芯片確診的部分標本進行GJB2基因的PCR擴增和測序，符合率為100%。對基因芯片法未能確診的患者標本進行基因測序，又發現GJB2純合突變1例(109A>G純合)，復合雜合突變1例(235delC+109A>G，本例已由基因芯片診斷為235delC單雜合突變)，單雜合突變7例(109G>A突變3例，139G>A突變1例，368C>A突變2例，439G>A突變1例)，其中2例(純合突變1例，復合雜合突變1例)確診為GJB2致聾。

兩種方法共檢測出34例患者有GJB2基因突變，突變檢出率為22.08%(34/154)，其中純合突變10例，復合雜合突變11例，單雜合突變13例；21例(13.64%，21/154)GJB2基因純合或復合雜合突變確診為GJB2基致聾，共檢測出7種GJB2基因突變(235delC、299delAT、176del16、109G>A、139G>A、368C>A、439G>A)，均為文獻及The connexin-deafness homepage已經報道的突變[3]，同時還檢出3種文獻報道過的多態(79G>A、341G>A、608T>C)[3,4]。GJB2基因檢測結果見表1。

對基因芯片檢出SLC26A4基因單雜合突變的10例標本進行PCR擴增及測序，在6例標本中檢測出了該基因另一個突變，證實為復合雜合突變，檢出率3.90%(6/154)，另外4例未檢測出另一突變。這10例均行顳骨高分辨率CT(HRCT)或MRI檢查，6例復合雜合突變者證實均為大前庭水管綜合征，4例單純雜合突變的患者中2人有前庭水管擴大，另2人未見異常。兩種方法共發現7種SLC26A4基因突變， 其中 6 種為報道過的突變(S391R、T410M、IVS15+5G>A、IVS7-2A>G、T94I和H723R)[5,6]，另一種為新發現的突變Q696X，是第18號外顯子2086位點的胞嘧啶突變為胸腺嘧啶(2086C>T)，導致編碼的696位上的谷氨酰胺改變為終止密碼子(圖1)。該突變的先證者為IVS7-2A>G和Q696X復合雜合突變，表現為前庭水管擴大伴極重度聾，其父母基因型分別為IVS7-2A>G和Q696X的單雜合子，聽力正常。由于該突變與耳聾表型相關，而且對100例正常人DNA樣本18號外顯子進行PCR擴增并測序，未檢測出相同突變，故認為Q696X是一個新的致聾突變而非多態。

在發現的10例SLC26A4基因突變者中，IVS7-2A>G所占的比例最高，達5.19%(8/154)，其次為H723R和T410M，各2例，檢出率均為1.30%(2/154)。10例患者的臨床表現和SLC26A4基因檢測結果見表2。

表1 154例患者GJB2基因突變檢測結果

圖1 突變2086C>T(Q696X)正向測序圖:左---野生型；右---突變型雜合子

表2 10例SLC26A4基因突變患者臨床表現和基因型

2.3基因芯片法及DNA測序法測得的基因突變檢出率比較 154例患者用基因芯片法檢測GJB2基因突變的檢出率為16.88%，DNA測序法的檢出率為22.08%，兩種方法檢出率的差異無統計學意義(χ2=1.325，P=0.25)。

3 討論

遺傳性聾具有高度的基因異質性，與耳聾有關的基因多達200多種，給病因診斷帶來很大困難。不過，中國人中最常見的GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA 3種致聾基因都有突變熱點，目前國內針對這些特點開發了遺傳性耳聾基因芯片，并用其檢測了大批患者[7]，本研究證實了該芯片的可靠性和實用性。

GJB2是發病率最高的遺傳性聾致聾基因，在中國人遺傳性聾患者中GJB2基因突變攜帶率約為21%[8]。本組對象中GJB2基因的突變率為22.08%，其中235delC是最常見的突變類型，與文獻相吻合[9]。本組患者299delAT突變檢出率僅次于235delC，說明109G>A突變也是本地區的另一個熱點突變，可以考慮在基因芯片中增加該位點的檢測。由于基因芯片快速、準確和低成本的優點，可用于GJB2基因的篩查，但由于基因芯片不能發現新的和少見的突變，還不能完全取代DNA測序。

SLC26A4基因型具有明顯的種族特異性，在中國人大前庭水管綜合征患者中最常見的SLC26A4基因突變類型是IVS7-2A>G，其次為H723R[12]。本研究應用基因芯片進行SLC26A4基因的快速篩查，發現IVS7-2A>G突變在本地區非綜合征型聾患者中攜帶率為5.19%，H723R突變攜帶率為1.30%；2名大前庭水管征患者只檢測出SLC26A4基因單個雜合突變，推測可能在患者基因的調控區或內含子區域有另一個突變；其余具有SLC26A4基因單純雜合突變，但沒有大前庭水管征表現的患者，則可能是由于其他原因致聾。

SLC26A4基因有21個外顯子，對患者的所有外顯子測序費時費力。根據中國人大前庭水管綜合征患者中IVS7-2A>G和H723R兩種突變高發的特點，本研究用基因芯片篩查這兩種突變的攜帶者后，再進行SLC26A4基因測序和影像學檢查確定是否為大前庭水管征患者。由于部分患者缺少這兩種突變，因此基因芯片法有一定的漏診率。

本研究共發現SLC26A4基因的7種突變，6種為報道過的突變(T94I、S391R、T410M、H723R、IVS7-2A>G和IVS15+5G>A)，分別位于SLC26A4基因的第3、10、19外顯子和第7、15內含子上；IVS7-2A>G和IVS15+5G>A為剪接區突變，其突變使前體mRNA不能正常剪接，影響Pendrin的翻譯。4種錯義突變(T94I、S391R、T410M、和H723R)可導致編碼的氨基酸改變，影響Pendrin的結構和功能[13]。本研究新發現的無義突變Q696X是第18號外顯子2086位胞嘧啶突變為胸腺嘧啶，導致編碼的696位上的谷氨酰胺改變為終止密碼子，使蛋白質的翻譯提前終止，推測其可導致Pendrin的結構和功能損害。這一新發現的突變對大前庭水管征的病因研究具有重要意義。

本次研究還檢出3例患者線粒體DNA12SrRNA基因突變，包括1555A>G均質突變2例，1494C>T均質突變1例。這3例患者沒有明確的耳毒性藥物應用史，不過其中2例有母系遺傳的家族史。1555A>G突變可以導致氨基糖苷類藥物相關的感音神經性聾，氨基糖苷類藥物致聾有兩種情況：一是用藥過量；二是正常用藥或是僅用少量的藥物就導致耳聾，即所謂“一針致聾”，后一類患者大多是線粒體基因突變的攜帶者[14]。1555A>G突變改變了人類線粒體小rRNA亞單位一個保守區域，增強了氨基糖苷類抗生素與線粒體核糖體的結合，破壞了線粒體蛋白質合成，減少ATP生成，導致毛細胞死亡。1555A>G是導致耳聾的最常見線粒體基因突變，據報道在中國人中的陽性率為1%～3%[14]。本研究在郴州地區非綜合征型聾患者中1555A>G突變檢出率為1.30%，與我國大部分地區的陽性率一致[8.12,15]。另一個藥物敏感致聾靶點1494C>T突變的檢出率為0.65%。對線粒體DNA12SrRNA基因突變的患者進行早期診斷，可以給其家族內的母系成員早期預防和干預，避免應用氨基糖苷類藥物，降低藥物性聾的發生率。

4 參考文獻

1 韓東一. 中國聾病防治現狀[J]. 中華耳科學雜志, 2007, 5:345.

2 戴樸, 于飛, 楊偉炎, 等. 線粒體DNA1555位點和GJB2基因及SLC26A4基因的診斷方法及臨床應用[J]. 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2005, 40:769.

3 Cx26 mutation database: http://davinci.crg.es/deafness/

4 Dai P, Yu F, Han B, et al. GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment[J]. J Transl Med, 2009, 7:26.

5 Hu H, Wu L, Feng Y, et al. Molecular analysis of hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct in the mainland Chinese: a unique SLC26A4 mutation spectrum[J]. J Hum Genet, 2007，52:492.

6 Albert S, Blons H, Jonard L, et al. SLC26A4 gene is frequently involved in nonsyndromic hearing impairment with enlarged vestibular aqueduct in Caucasian populations[J]. Eur J Hum Genet, 2006, 14:773.

7 Li CX, Pan Q, Guo YG, et al. Construction of a multiplex allele-specific PCR-based universal array(ASPUA) and its application to hearing loss screening[J]. Hum Mutat, 2008, 29:306.

8 于飛, 韓東一, 戴樸, 等. 1190例非綜合征性耳聾患者GJB2基因突變序列分析[J]. 中華醫學雜志, 2007, 87:2 814.

9 Dai P, Yu F, Han B, et al. The prevalence of the 235delC GJB2 mutation in a Chinese deaf population[J]. Genet Med, 2007, 9: 283.

10 Scott DA, Wang R, Kreman TM, et al. Functional differences of the PDS gene product are associated with phenotypic variation in patients with Pendred syndrome and non-syndromic hearing loss (DFNB4)[J]. Hum Mol Genet, 2000, 9:1 709.

11 Tsukamoto K, Suzuki H, Harada D, et al. Distribution and frequencies of PDS (SLC26A4) mutations in Pendred syndrome and nonsyndromic hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct: a unique spectrum of mutations in Japanese[J]. Eur J Hum Genet, 2003, 11:916.

12 Wang QJ, Zhao YL, Rao SQ, et al. A distinct spectrum of SLC26A4 mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct in China[J]. Clin Genet, 2007, 72: 245.

13 趙亞麗, 李慶忠, 翟所強, 等. 國人前庭水管擴大患者SLC26A4基因的特異性突變[J]. 聽力學及言語疾病雜志，2006, 14:93.

14 劉新, 戴樸, 黃德亮, 等. 線粒體DNAA1555G突變大規模篩查及其預防意義探討[J]. 中華醫學雜志, 2006, 86:1 318.

15 王秋菊, 韓明鯤, 劉曉雯, 等. 值得關注的線粒體12SrRNA C1494T突變—藥物敏感致聾靶點[J]. 聽力學及言語疾病雜志, 2008,16: 446.