一株具有羽毛降解活性的益生菌的篩選和應用

龔一軒，張桂敏，馬立新

(湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062)

羽毛是鳥類和禽類表皮細胞角質化的衍生物，其中蛋白質含量高達90%[1].動物的大量消費產生許多羽毛廢棄物，傳統處理方法主要為填埋、焚燒，造成了羽毛蛋白資源的浪費.羽毛中蛋白主要是角蛋白，因含大量二硫鍵，交聯成復雜的三維網狀結構，具有良好的穩定性和難溶性，在一般自然環境中很難將其降解[2].目前羽毛的降解并再利用的途徑有物理降解法、化學降解法、酶降解法和微生物降解法[3].盡管物理、化學方法研究較早，但存在破壞氨基酸結構、產物單一以及產物穩定性差等缺點[4].用化學法更是會在生產中產生大量的鹽使產品適口感較差[5].目前羽毛降解用酶因為表達量低[6-7]、生產成本過高、降解效率低等原因尚未工業化應用，利用微生物對廢棄羽毛進行降解便成為一種較為合適的選擇.利用微生物來降解廢棄羽毛已有很多報道[8-10]，但是這些微生物降解羽毛產生的小肽也大多被微生物自身所利用，如果降解菌株不是有用的菌體，那么這些羽毛蛋白還是被白白浪費掉.也有從羽毛腐爛物中分離到地衣芽孢桿菌降解羽毛的報道[11]，但是，環境中分離的地衣芽孢桿菌也需要做一系列的安全性評價，才能作為安全微生物用于生產.

益生菌可調整菌群失調達到防病的目的，可促使機體產生抗菌活性物質、殺滅致病菌，而且益生菌產生的抗活性物質，具有獨特的生物奪氧作用機制，能抑制致病菌的生長繁殖[12].但目前尚少見利用益生菌降解廢棄羽毛并獲得益生菌產品的報道.本實驗從市售的益生菌中篩選出能高效降解羽毛的地衣芽孢桿菌，從羽毛的前處理、接種量、培養基的成分、發酵時間及產物成分多角度優化羽毛降解工藝，得到一種利用益生菌高效降解羽毛獲得菌肽新型飼料添加劑的工藝流程.

1 材料與方法

1.1供試材料市售益生菌；羽毛，由菜場收購；LB液體培養基：0.5%酵母粉(質量分數，全文同)，1%蛋白胨，1%NaCl，水；羽毛篩選培養基：2%羽毛，1%NaCl，水；優化羽毛發酵培養基：2%羽毛，0.3%硝酸鉀，0.1%磷酸氫二鉀，0.06%磷酸二氫鉀，0.04%六水氯化鎂，0.5% NaCl，0.1%山梨醇，水[10].

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的篩選 選購4種市售的單一益生菌，分別為：蘇柯漢牌的短小芽孢桿菌、蘇柯漢牌的乳酸菌、動物飼料添加劑牌的枯草芽孢桿菌及科諾公司生產的地衣芽孢桿菌，并將其編號為HUBM1、HUBM2、HUBM3、HUBM4.將上述4種產品溶于無菌水，并分別在固體LB平板上分區劃線活化并獲得單菌落.次日，挑單菌落接種至250 mL錐形瓶中，瓶內含50 mL羽毛篩選培養基，在37 ℃，200 r/min的條件下搖瓶發酵，觀察對比這些菌株發酵降解羽毛的效果，挑選出降解羽毛效率最高的菌株.

1.2.2 菌株的鑒定 抽提該菌染色體DNA，并以該DNA為模板，利用正向引物：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCT)和反向引物1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，進行PCR反應，反應條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min 30 s；72 ℃，7 min.將PCR產物膠內回收送出測序，測序結果通過BLAST同源比對[13]鑒定菌種.

1.2.3 羽毛最適預處理方法研究 分別用4種方法處理同一批羽毛，A為羽毛經粉碎處理；B為羽毛用121 ℃高溫處理30 min；C為羽毛在0.02%NaOH溶液中沸水浴15 min；D為羽毛同時經過0.02%NaOH沸水浴15 min及121 ℃高溫處理30 min.用這4種經過不同預處理的羽毛分別配制成羽毛篩選培養基.接入HUBM2，并在37 ℃，200 r/min的條件下搖床發酵，觀察羽毛降解效果.

1.2.4 搖瓶發酵培養基的優化 在250 mL的錐形瓶中分別配制100 mL的羽毛篩選培養基(A)、LB培養基+2%羽毛(B)和優化羽毛發酵培養基(C)，接種菌株HUBM2，在37 ℃，200 r/min的條件下培養，觀察各培養基羽毛的狀態，測定菌體的變化量、羽毛降解率及可溶性蛋白和小肽含量.

1.2.5 最佳接種量的優化 接種一環HUBM2于100 mL LB培養基中，37 ℃，200 r/min的條件下搖瓶發酵12 h，做為種子液.配制4瓶100 mL羽毛篩選培養基于250 mL錐形瓶中，將上述種子液分別按5%、10%、15%、20%的菌液接種.其中5%和10%比例的采用菌液接種，直接接種種子液于羽毛發酵培養基；15%和20%比例的采用菌體接種，是將菌液收集至50 mL滅菌離心管，5 000 r/min離心8 min后棄上清將菌體沉淀接種至羽毛篩選培養基.將接種好的培養基置于37 ℃，200 r/min的條件下培養，觀察培養基形態變化.

1.2.6 最大降解率的測定 用電子天平稱量濾紙質量m1.將最佳效果的搖瓶培養的羽毛發酵液稀釋3倍，用玻璃棒引流至裝了之前稱量的濾紙的漏斗中.在此過程中不斷往漏斗中加水稀釋，并用玻璃棒攪拌，確保菌體和殘余羽毛能夠完全分離.待全部發酵液過濾完后，將濾紙連同濾渣一同放入60 ℃烘箱內烘干至質量不再減少，稱得總質量m2.培養基中添加羽毛的總含量為m3.羽毛降解率按公式：降解率P=1-(m2-m1)÷m3×100%計算.

1.2.7 益生菌活菌數的測定 分別取1 mL接種后的培養基和發酵結束后的發酵液，編號A、B.采用平板稀釋菌落計數法，將A、B液分別用無菌水進行10倍的梯度稀釋至10-5～10-7.將每個稀釋度分別取100 μL涂布兩塊LB平板，放入37 ℃培養過夜.次日統計每塊平板的菌體數，取菌體數在30～200個之間的平板為有效樣品，求平均菌體數.最后根據梯度稀釋的倍數推算出100 μL菌液的菌體數含量，進而計算出發酵液中總的活菌體數.

1.2.8 可溶性蛋白或小肽含量測定 用Bradford法[14]測量發酵上清可溶性蛋白或小肽的含量，用蒸餾水配制0.5 mg/mL的小牛血清蛋白做為標準蛋白.取發酵初末兩個狀態的發酵液1 mL，離心取上清，編號a、b.在96孔板中A行依次分別加入0、1、2、4、8、12、16、20 μL的標準蛋白，用蒸餾水補齊至20 μL，在B、C行重復2次，共3組.在96孔板中D行依次分別加入2、4、8、16、20 μL a、b樣品，用蒸餾水補齊至20 μL，在E，F行重復兩次，共3組.在上述每個孔補加200 μL G250工作液，37 ℃反應2 min后，將96孔板放入酶標儀在595 nm波長下讀數.利用A、B、C 3行的數據制作標準曲線，計算出a、b兩個樣品的可溶性蛋白及小肽含量.

2 結果與分析

2.1羽毛降解益生菌的篩選與鑒定4種市售的益生菌經過7 d的培養后觀察，降解羽毛效果最好的菌株是HUBM2.抽提HUBM2菌株的染色體DNA，PCR擴增其16SrDNA編碼序列，測序結果通過BLAST進行同源比對分析，結果顯示該益生菌與多個Bacilluslicheniformis菌株的16SrDNA編碼序列一致性為100%，其中已報道的是BacilluslicheniformisATCC14580[15]，因為地衣芽孢桿菌是FDA認定的安全微生物，加之分離自已經產業化的益生菌，因此，鑒定菌株HUBM2是地衣芽孢桿菌.

2.2羽毛預處理方法對羽毛降解的影響按方法1.2.3中所述，4瓶發酵物搖床培養7 d后觀察結果，如圖1所示.由圖1可以看出B方法利用高溫處理的羽毛降解效果略好于A方法經粉碎處理的效果，而通過C方法稀堿煮的羽毛的降解效果要遠好于B和A方法，而用兩種方法綜合處理的D方法的羽毛降解效果和用C方法稀堿煮的羽毛的降解效果相差無幾.而羽毛一經粉碎后，體積特別大，操作不方便.因此，稀堿煮處理羽毛能夠有效地破壞羽毛中的二硫鍵及其空間結構，使羽毛變得更加容易被降解，而且可操作性強.

圖1 4種不同羽毛預處理方法發酵5 d后的形態

2.3不同培養基對羽毛降解效果的影響按方法1.2.4中所述，分別接種HUBM2到3種不同的培養基，發酵培養5 d后觀察結果，測定羽毛降解率、可溶性小肽和氨基酸含量、菌體生長量，結果如表1所示.由表1可以看出，益生菌HUBM2在優化培養基能夠最好地將羽毛降解.由于羽毛培養基中沒有可溶性的碳氮源，而剛接種的菌體處在遲緩期，所以發酵前期生長極其緩慢，因此A培養基中的生物量在5天時增長量很少且羽毛降解的也很少.LB培養基，菌體生長得很快然而羽毛的降解卻幾乎沒有，原因可能是由于菌體優先利用了LB培養基中的碳氮源.

表1 不同培養基對羽毛降解效果的影響

表2 不同接種量和種子對發酵結果的影響

2.4接種量對羽毛降解的影響按方法1.2.5中所述，不同接種量的4瓶發酵物搖床培養2～5 d，每天觀察羽毛降解狀態，如表2所示.由表2可以看出接種10%菌液的羽毛降解效果最好，而接種種子液的發酵樣品降解羽毛的效果要明顯好于接種菌體時降解羽毛的效果.這可能一是因為菌液中還有殘存的LB培養基，二是菌體處于對數期，因此使轉接后的遲緩期縮短.

2.5最佳發酵條件下的發酵相關結果利用摸索好的條件：使用0.02%NaOH溶液沸水浴處理15 min

表3發酵前后活菌體數及可溶性蛋白含量的變化

發酵前發酵后活菌體數/CFU4×10102×1012可溶性蛋白含量/(mg/mL)00．41

圖2 發酵始末菌體形態變化

的羽毛，以優化羽毛發酵培養基為發酵底物，按10%的接種量接種益生菌HUBM2菌液，在37 ℃，200 r/min的條件下發酵48 h.測定樣品發酵液菌體數變化及發酵液上清可溶性蛋白質及小肽含量變化.結果如表3.由表3可知益生菌利用羽毛做為唯一碳氮源，活菌體數從接種時的4×1010CFU增加到2×1012CFU，增長了50倍左右.可以看出，可溶性蛋白和小肽含量從完全沒有而達到0.41 mg/mL.因此益生菌降解羽毛，利用羽毛降解蛋白自身增殖的同時，也有少量可溶性蛋白和小肽未被利用.

2.6發酵始末菌體形態變化如圖2A發酵初期菌體都為營養細胞，且數量較少；發酵中期菌體數明顯增加，出現營養細胞和芽孢共存的情況，且可以看見較大的羽毛碎片；發酵末期(圖2B)菌體幾乎全為芽孢形態，且數量明顯增多，未見明顯的羽毛碎片.由于芽孢的抗逆性極強，能耐高溫，當發酵液中的菌體大多以芽孢形式存在時，為發酵液的后處理和制備新型菌肽飼料添加劑提供了長期保藏的基礎.

3 討論

本研究利用市售益生菌對羽毛進行生物降解，該菌較之其他益生菌有較強的降解羽毛的能力，它有效地解決了廢棄羽毛的處理問題并得到含有大量益生菌及可溶性的蛋白質和短肽的發酵液，該發酵液經過噴霧干燥后可制備含有益生菌和蛋白肽的新型飼料添加劑.在發酵條件的優化中，發現羽毛經過稀堿處理和提高降解的效率，一般來說，酸堿處理會引起環境污染，但是本研究采用的是0.02%的稀堿溶液，廢液采用稀酸中和后，可以用普通的活性污泥法處理即可排放.按10%的接種量接種種子液，經過約48 h的發酵可將羽毛基本降解，羽毛降解率約80%，發酵液呈灰褐色，發酵液中生物量達到較高水平，可溶性蛋白也達到峰值，芽孢桿菌絕大多數變為芽孢.將發酵液通過紗網濾去固形羽毛殘余物后，加入填充劑，噴霧干燥后得到含有大量益生菌、少量的可溶性蛋白或短肽的新型飼料添加劑.

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