葉綠酸鐵與環糊精包合性質的初步研究

孫俊梅，曾建，任勇

(1.成都大學生物產業學院，四川 成都 610106；2.南京師范大學江蘇省醫藥超分子材料及應用重點實驗室，江蘇 南京 210097)

葉綠酸合鐵(簡稱葉綠酸鐵或鐵葉綠酸)是葉綠素的金屬螯合物，結構與人體血紅素相似；其可溶性鈉鹽是中藥生血寧的主要有效成分，機體吸收后可促進血紅蛋白再生和補充機體鐵元素，是治療缺鐵性貧血的良好藥物.葉綠酸鐵鈉溶液pH高，稀釋后易水解而析出難溶的酸型葉綠酸鐵沉淀，溶液中及固體制劑的光、熱穩定性皆較差，影響產品質量.因此提高酸型葉綠酸鐵溶解性和穩定性，對改進生血寧產品具有重要意義.環糊精(CD)是葡糖糖殘基以α-1，4糖苷鍵連接而成的環狀化合物.CD具有“外親水內疏水”的特點，可形成包合物改善客體分子的溶解度、溶出速度、穩定性和生物利用度等性質.常用天然CD有α-CD、β-CD、γ-CD.

本文中依據藥物結構特性研究了葉綠酸鐵與α-、β-和γ-CD的包合作用，表明包合技術對葉綠酸鐵的性質具有良好的改進作用，其研究目前尚少見報道.

1 實驗部分

1.1儀器與試劑Explorer電子分析天平(Ohaus Corporation USA)，UV-2450型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)，KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，葉綠酸鐵(江蘇省醫藥超分子材料及應用重點實驗室提供)，β-環糊精(上海化學試劑公司，重結晶2次)，α-環糊精(廣州Maxdragon公司)，γ-環糊精(廣州Maxdragon公司)，pH 6.86磷酸緩沖鹽(上海雷磁創益儀器儀表有限公司).

1.2包合常數的測定[1-3]取pH 6.86磷酸鹽緩沖液(25 mmol/L)配制一定濃度的葉綠酸鐵溶液A，取溶液A配制CD的濃溶液B.取A液2.5 mL進行紫外掃描，依次向體系中加入20 μL的B液，記錄體系紫外吸光度的變化.以1/ΔA對1/[CD] 作圖，通過回歸直線的斜率和截距可求得CD與葉綠酸鐵的表觀一級包合常數Ka.其中ΔA為加入CD后體系紫外吸光值的變化，[CD]為體系中CD的濃度.

1.3包合物的制備[4]采用研磨法制備包合物.精密稱取葉綠酸鐵以5倍量乙醇溶解，取3倍摩爾比的CD加入適量pH 6.86 磷酸鹽緩沖液和葉綠酸鐵乙醇溶液，常溫錫箔紙避光研磨，至粘稠的糊狀后室溫真空干燥得固體包合物.

1.4 溶解性質研究

圖1 葉綠酸鐵溶液標準曲線

1.4.1 檢測波長選擇 取含10%乙醇的pH 6.86磷酸鹽緩沖液配制適當濃度葉綠酸鐵溶液，200～500 nm區間掃描顯示葉綠酸鐵在398.5 nm 有強紫外吸收峰且該波長下CD無吸收，故選擇該波長作為檢測波長.

1.4.2 標準曲線制備 精密稱取葉綠酸鐵10 mg于200 mL容量瓶，加入20 mL無水乙醇超聲使其溶解，取pH 6.86磷酸鹽緩沖液稀釋并定容得母液；分別量取母液并用相同緩沖液稀釋成8.0 ～ 36.0 μg/mL 系列濃度測試液，測定并記錄398.5 nm吸光度，以吸光度(A)對濃度(C)作圖(圖1)，線性回歸得標準方程：A=0.019 9C-0.003 1 (r=0.999 9).

1.4.3 溶出度和溶解度 分別取葉綠酸鐵原料及相應量β-CD包合物置于50 mL燒杯，加入20 mL pH 6.86磷酸鹽緩沖液，震蕩2 min觀測溶解速度，濾取溶液測定吸光度；另取樣品避光超聲30 min后靜置5 h，濾取濾液稀釋后測定吸光度，由標準曲線得葉綠酸鐵溶解度.

1.5樣品溶液光穩定性的研究取pH 6.86磷酸緩沖鹽配制濃度40 μg/mL的葉綠酸鐵溶液或包合物溶液，測定各樣品吸光度A0，然后分別裝于3只具塞試管，分別置于恒溫棕色干燥器，1 000 lx 和4 000 lx光照箱，設定時間點分別取樣，測定葉綠酸鐵的含量或殘留率，通過曲線回歸推算藥物的半衰期.

1.6固體樣品熱穩定性取葉氯酸鐵及CD 包合物固體少許，測定含量后(0 d)于40 ℃溫度下放置10 d，分別在5 d 和10 d 檢測樣品中葉氯酸鐵的含量.

2 結果及討論

表1 葉綠酸鐵與CD的Ka及回歸方程(398.5 nm)

2.1Ka的測定CD與客體分子的包合是一個動態平衡過程，包合物形成后，客體分子的吸收光譜產生位移或吸光強度發生改變.根據吸光度隨CD濃度的變化可求得Ka(表1)，Ka值越大越易形成穩定的包合物.

實驗發現，葉綠酸鐵的紫外吸光度隨著CD濃度的增大而增大，說明二者之間發生包合作用.另從表1可知，葉綠酸鐵與CD的Ka為7.9～2 869.8 L/mol，呈現β-CD>α-CD >γ-CD的規律，表明β-CD與葉綠酸鐵包合效果最好.

圖2 葉綠酸鐵結構及分子尺寸

葉綠酸鐵分子結構如圖2所示，采用ChaChe WorkSystem Pro.(6.1.8) 分子模擬系統計算葉綠酸鐵分子各基團間距及CD內腔大小見表2.

由表2可知，葉綠酸鐵分子母核兩端原子間距較大，不易進入CD疏水內腔，其支鏈a空間為0.352 1 nm小于CD內徑，是形成包合的主要部位.β-CD的空腔內徑與葉綠酸鐵支鏈空間基本適合，易于發生相互作用而形成穩定的包合物；而α-CD由于環的內徑較小，匹配作用稍差而弱于β-CD的包合；γ-CD較大的空腔，疏水作用減弱包合松散，其作用力不足以使葉綠酸鐵與γ-CD以穩定的包合物形式存在.

表2 CD與葉綠酸鐵的計算機分子模擬結果

由于β-CD包合葉綠酸鐵具有最大的Ka，所以進一步制備β-CD-葉綠酸鐵包合物，考察β-CD對葉綠酸鐵溶解度和光、熱穩定性的影響，探索β-CD包合葉綠酸鐵的改進效果及技術可行性.

2.2溶解性能研究測定結果顯示，葉綠酸鐵固有溶解度為81.6 μg/mL，但震蕩2 min幾乎不溶解(<8.0 μg/mL)；β-CD包合物震蕩即快速分散溶解、溶液顏色迅速加深，2 min溶出量35.1 μg/mL；包合物溶液平衡后溶解度114.9 μg/mL，為葉綠酸鐵溶解度的140%，表明β-CD對改善葉綠酸鐵溶解度尤其是溶出度具有明顯效果.

2.3光穩定性的研究表3為試驗條件下溶液中各樣品降解半衰期(T1/2).由表可知，避光條件下，樣品β-CD對葉綠酸鐵的作用導致穩定性略有下降，T1/2稍短于原料藥，然而隨著光照強度的增大，各樣品分解的T1/2均逐漸減小(穩定性降低)，但包合態葉綠酸鐵的T1/2減小幅度顯著弱于原料藥，β-CD的穩定性增強效果明顯.說明葉綠酸鐵與β-CD形成的包合物有利于增強葉綠酸鐵的光穩定性.

2.4熱穩定性的研究40 ℃條件下，5 d后葉綠酸鐵及包合物的藥物相對含量分別從0 d的100%降至58.4%和73.9%，10 d后進一步降到36.6%和52.3%；葉綠酸鐵包合物含量均明顯高于葉綠酸鐵原料.由此說明，CD包合使葉綠酸鐵的熱穩定性得到明顯提高，有利于延長產品貨架期.

表3 試驗條件下樣品光穩定性的半衰期 h

3 小結

本文中通過研究系列CD與葉綠酸鐵的Ka，探索CD包合葉綠酸鐵的可能性，選擇Ka較大的β-CD制得穩定的包合物，通過樣品溶解性和光熱穩定性測定證明包合技術對改進葉綠酸鐵藥學性質具有可行性.該結果對深入研究開發新型葉綠酸鐵補血制劑提供了重要的技術基礎.

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