HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其融合蛋白生物活性預(yù)測(cè)

張歡，吳金明，陳娟，方紅龍

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325000）

乙肝病毒性肝炎是世界范圍內(nèi)廣泛傳播的傳染病，控制乙型肝炎病毒（HBV）的復(fù)制、緩解肝組織活動(dòng)性病變是醫(yī)學(xué)界需要長(zhǎng)期攻克的堡壘。近幾年來研究表明HBV感染的控制和清除有賴于機(jī)體的免疫系統(tǒng)，其感染慢性化與機(jī)體針對(duì)HBV的特異性免疫，尤其是細(xì)胞免疫的缺陷與低下有關(guān)。但現(xiàn)在的抗病毒藥物均不能糾正這種免疫缺陷，基于上述情況，探索新的治療性疫苗具有現(xiàn)實(shí)意義。治療疫苗與預(yù)防疫苗不同，是基于病毒慢性感染時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)處于不合適的免疫狀態(tài)，不能有效清除病毒感染的理論基礎(chǔ)而提出的新的治療策略[1]。乙肝治療性疫苗著眼于增強(qiáng)或恢復(fù)機(jī)體針對(duì)HBV的特異性免疫，尤其是特異性T細(xì)胞免疫，以控制和清除病毒而不損傷肝細(xì)胞，最終達(dá)到消除HBV感染的目的。

1 材料和方法

1.1 材料 NheI和BamHI限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas，質(zhì)粒提取試劑盒及pEGFPN1質(zhì)粒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，PCR引物序列合成及DNA序列測(cè)定由上海捷瑞生物有限公司完成。ayr亞型HBV e基因序列由上海捷瑞生物有限公司合成（GeneBank編號(hào)NC_003977），人CD40L胞外段基因序列（GeneBank編號(hào)NM_000074），連接鏈（Linker）氨基酸序列為GGGG。

1.2 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 根據(jù)HBe（385-420）基因序列以及人CD40L胞外段基因序列合成并純化4條引物，序列如下：上游引物A：5’-GCTAGCGATGCCTCCCG-3’，中間引物B：5’-TTCTATGAAGGCCGCC-3’，中間引物C：5’-CGGCGGCG GCCTTCATAGA-3’，下游引物D：5’-GGATCCCGGAGTTTGA GTAAGC-3’。A為HBe（385-420）基因的上游引物，引入NheI酶切位點(diǎn)；B和C是部分互補(bǔ)的，分別含HBe（385-420）C端堿基和ecdCD40L N端堿基；D為CD40L的下游引物，引入BamHI酶切位點(diǎn)。

1.2.2 HBe（385-420）-ecdCD40L融合基因的構(gòu)建PCR過程：第一次PCR：以HBe（385-420）為模板，用引物A和B擴(kuò)增e129-140基因片段。用細(xì)胞總RNA快速提取試劑盒提取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，再通過RT-PCR法擴(kuò)增CD40L胞外段。RT反應(yīng)條件：65 ℃ 1 min，30 ℃ 5 min，20 min勻速升溫至65 ℃，65 ℃ 20 min，98 ℃ 5 min。將RT產(chǎn)物（cDNA）置于-20 ℃保存。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，接著94 ℃變性30 s、56.4 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延長(zhǎng)50 s，共28個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min后終止反應(yīng)。然后按照膠回收試劑盒操作說明回收純化產(chǎn)物。第二次PCR，兩個(gè)基因的PCR產(chǎn)物回收后，各取1μL加至同一體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，不加入引物。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，接著94 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性1 min，72℃延長(zhǎng)1 min，5個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。第三次PCR，以第二次PCR產(chǎn)物為模板，用引物A和D擴(kuò)增，獲得基因片段HBe（385-420）-LecdCD40L。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，接著94 ℃變性30 s、56.4 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延長(zhǎng)50 s，共30個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min后終止反應(yīng)。回收第三次PCR產(chǎn)物。

1.2.3 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達(dá)載體的構(gòu)建：HBe（385-420）-ecdCD40L基因與pEGFP-N1通過雙酶切（NheI和BamHI）且在T4 ligase作用下連接成pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達(dá)載體。

1.3 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達(dá)載體軟件分析 參考林賢凡等[2]的軟件分析方法，融合蛋白的理化性質(zhì)使用ProtParam tool方案以及DNAStar軟件中的Protean程序進(jìn)行分析；用www.expasy.org網(wǎng)站提供的Protscale方案和Protean程序進(jìn)行融合蛋白的柔性分析；應(yīng)用Protean程序分析其抗原性以及表位；應(yīng)用www.expasy.org網(wǎng)站提供的HNN方案分析融合蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 HBe（385-420）-ecdCD40L 融合基因共714 bp，其PCR結(jié)果見圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增出的目的片段，大小為714bp

圖2 質(zhì)粒pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L經(jīng)HindIII/BamHI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定 所構(gòu)建質(zhì)粒 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L經(jīng)HindIII/BamHI雙酶切后片段大小分別為241 bp和5131 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，片段大小符合（見圖2）。

2.3 測(cè)序鑒定 測(cè)序結(jié)果證明pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L成功構(gòu)建，融合基因插入方向正確。經(jīng)DNAman軟件比對(duì)，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中pEGFPN1-HBe（385-420）-ecdCD40L融合基因序列與原設(shè)計(jì)相符（見圖3）。

圖3 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L測(cè)序

圖4 HBe129-140-ecdCD40L、HBe129-140、ecdCD40L親水性、柔性、抗原性及表位

2.4 融合蛋白HBe（129-140）-ecdCD40L的理化性質(zhì)分析結(jié)果 分子量為25904.4 Da，等電點(diǎn)為8.55，負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為23，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為26，分子式為C1142H1805N321O347S10，不穩(wěn)定系數(shù)為46.84，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。通過Protean軟件分析可知HBe（385-420）、ecdCD40L兩個(gè)基因連接之后的親水性和疏水性未受影響（見圖4）。

2.5 柔性分析結(jié)果 經(jīng)分析，14到17位氨基酸（linker所在部位）存在高柔性區(qū)，連接鏈兩側(cè)的柔性區(qū)未發(fā)生改變（見圖4-5）。

圖5 HBe129-140-ecdCD40L柔性分析

2.6 抗原性分析 結(jié)果顯示Linker部位抗原性低，并且兩側(cè)HBe（129-140）及ecdCD40L氨基酸序列的抗原性未發(fā)生改變（見圖4）。

圖6 HBe129-140-ecdCD40L二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.7 表位分析結(jié)果 通過軟件分析顯示HBe（129-140）-ecdCD40L沒有新的表位出現(xiàn)，14～17位氨基酸表位值低（見圖4）。

2.8 HBe（129-140）-ecdCD40L融合蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 提示二級(jí)結(jié)構(gòu)由Alpha helix（Hh）為34.33%，Extended strand（Ee）為19.74%，Random coil（Cc）為45.92%構(gòu)成，linker所在部位基本為無規(guī)卷曲，不影響兩側(cè)HBe（129-140）和ecdCD40L結(jié)構(gòu)（見圖6）。

3 討論

HBeAg血清轉(zhuǎn)換是目前抗HBV病毒的治療目標(biāo)，也是HBV慢性感染進(jìn)入低或非復(fù)制期的標(biāo)志，可見HBeAg特異性免疫反應(yīng)一旦獲得，機(jī)體內(nèi)HBV的復(fù)制將能得到有效的控制[3]，并且體外HBeAg具有較強(qiáng)的免疫原性，以HBeAg作為免疫原研究乙肝治療性疫苗涉及到如何增強(qiáng)疫苗免疫原性，增強(qiáng)其誘發(fā)的HBeAg特異性免疫反應(yīng)的問題。

HBeAg的優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞識(shí)別表位分別為HBe（120-131）（VSFGVWIRTPPA）和 HBe（129-140）（PPAYRPPNAPIL）；通過Milich等[4]研究證明：相對(duì)于HBe（129-140），HBe（120-131）容易誘導(dǎo)免疫耐受，HBe（129-140）作為HBeAg的優(yōu)勢(shì)表位，重要的特點(diǎn)是能夠逃避免疫耐受誘導(dǎo)的同時(shí)能夠引起體內(nèi)自身免疫性反應(yīng)。

樹突狀細(xì)胞（DC）是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，能攝取、加工并遞呈抗原，刺激初始T細(xì)胞的增殖、活化從而啟動(dòng)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，CD40L信號(hào)有助于DC的分化與成熟，反之DC的CD40信號(hào)也能促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞甚至直接促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞的活化與效應(yīng)功能的產(chǎn)生。經(jīng)CD40L刺激后的DCs具有如下特性：①DCs抗原遞呈能力增強(qiáng)。②DCs具有較強(qiáng)的T淋巴細(xì)胞趨化能力。③DCs體外刺激T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力增強(qiáng)。④DCs表面的共刺激分子（CD80、CD86等）明顯上調(diào)，能夠產(chǎn)生較高水平的IL-12、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，并使Th0向Th1分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答[5]。

Li等[6]研究曾發(fā)現(xiàn)，將腫瘤相關(guān)抗原E7與ecdCD40L基因融合構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體，表達(dá)的融合蛋白對(duì)DC具有明顯刺激作用，且ecdCD40L可增強(qiáng)E7的免疫原性，提示將ecdCD40L與抗原基因融合是切實(shí)可行的，且具有明顯的免疫增強(qiáng)效果。結(jié)合CD40L可靶向作用于DC，促進(jìn)DC成熟，誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫，具有免疫增強(qiáng)作用。鑒于此，本研究將HBe（385-420）基因與CD40L胞外段（ecd）基因融合，構(gòu)建真核表達(dá)載體，ecdCD40L可增強(qiáng)HBe（385-420）免疫原性，誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異性T細(xì)胞免疫，為乙肝治療性疫苗的研究作準(zhǔn)備。

為了確保重組融合蛋白各個(gè)部分不會(huì)相互干擾而形成非天然構(gòu)象，本研究引人了linker序列，構(gòu)建了HBe（385-420）、CD40L胞外段重組表達(dá)載體pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L，通過酶切和測(cè)序鑒定載體構(gòu)建成功，并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)其空間結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。通過對(duì)重組表達(dá)載體的全面分析，促進(jìn)我們對(duì)融合蛋白HBe（385-420）-ecdCD40L更深的認(rèn)識(shí)，并且證實(shí)重組體設(shè)計(jì)的合理性，表達(dá)的蛋白生物活性在融合過程中未受影響，這為我們以后基因體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] Autran B,Carcelain G,Combadiere B, et al.Therapeutic vaccines for chronic infections[J].Science,2004,305(5681):205-208.

[2] 林賢凡,吳金明,陳瑾,等.乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白的設(shè)計(jì)和生物活性預(yù)測(cè)[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,39(3):205-208.

[3] 閆濤,李梵,王慧芬,等.探討慢性乙型肝炎患者的HbeAg血清轉(zhuǎn)換[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32(1):21-22,31.

[4] Milich DR, McLachlan A K, Raney AK, et al. Autoantibody production in hepatitis B e antigen transgenic mice elicited with a self T-cell peptide and inhibited with nonself peptides[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(10):4348-4352.

[5] Liu Y,Zhang X,Zhang W, et al. Adenovirus-mediated CD40 ligand gene-engineered dendritic cells elicit enhanced CD8(+) cytotoxic T-cell activation and antitumor immunity[J].Cancer Gene Ther,2002,9(2):202-208.

[6] Zhang L,Tang Y,Akbulut H,et a1.An adenoviral vector cancer vaccine that delivers a tumor-associated antigen/CD40-ligand fusion protein to dendritic cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(25):15101-15106.