HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達載體的構建及其融合蛋白生物活性預測

張歡，吳金明，陳娟，方紅龍

（溫州醫學院附屬第一醫院 消化內科，浙江 溫州 325000）

乙肝病毒性肝炎是世界范圍內廣泛傳播的傳染病，控制乙型肝炎病毒（HBV）的復制、緩解肝組織活動性病變是醫學界需要長期攻克的堡壘。近幾年來研究表明HBV感染的控制和清除有賴于機體的免疫系統，其感染慢性化與機體針對HBV的特異性免疫，尤其是細胞免疫的缺陷與低下有關。但現在的抗病毒藥物均不能糾正這種免疫缺陷，基于上述情況，探索新的治療性疫苗具有現實意義。治療疫苗與預防疫苗不同，是基于病毒慢性感染時，機體的免疫系統處于不合適的免疫狀態，不能有效清除病毒感染的理論基礎而提出的新的治療策略[1]。乙肝治療性疫苗著眼于增強或恢復機體針對HBV的特異性免疫，尤其是特異性T細胞免疫，以控制和清除病毒而不損傷肝細胞，最終達到消除HBV感染的目的。

1 材料和方法

1.1 材料 NheI和BamHI限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas，質粒提取試劑盒及pEGFPN1質粒購自上海捷瑞生物工程有限公司，逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR引物序列合成及DNA序列測定由上海捷瑞生物有限公司完成。ayr亞型HBV e基因序列由上海捷瑞生物有限公司合成（GeneBank編號NC_003977），人CD40L胞外段基因序列（GeneBank編號NM_000074），連接鏈（Linker）氨基酸序列為GGGG。

1.2 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達載體的構建

1.2.1 根據HBe（385-420）基因序列以及人CD40L胞外段基因序列合成并純化4條引物，序列如下：上游引物A：5’-GCTAGCGATGCCTCCCG-3’，中間引物B：5’-TTCTATGAAGGCCGCC-3’，中間引物C：5’-CGGCGGCG GCCTTCATAGA-3’，下游引物D：5’-GGATCCCGGAGTTTGA GTAAGC-3’。A為HBe（385-420）基因的上游引物，引入NheI酶切位點；B和C是部分互補的，分別含HBe（385-420）C端堿基和ecdCD40L N端堿基；D為CD40L的下游引物，引入BamHI酶切位點。

1.2.2 HBe（385-420）-ecdCD40L融合基因的構建PCR過程：第一次PCR：以HBe（385-420）為模板，用引物A和B擴增e129-140基因片段。用細胞總RNA快速提取試劑盒提取健康人外周血單個核細胞的總RNA，再通過RT-PCR法擴增CD40L胞外段。RT反應條件：65 ℃ 1 min，30 ℃ 5 min，20 min勻速升溫至65 ℃，65 ℃ 20 min，98 ℃ 5 min。將RT產物（cDNA）置于-20 ℃保存。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，接著94 ℃變性30 s、56.4 ℃復性30 s、72 ℃延長50 s，共28個循環。循環結束后72 ℃延伸7 min后終止反應。然后按照膠回收試劑盒操作說明回收純化產物。第二次PCR，兩個基因的PCR產物回收后，各取1μL加至同一體系進行PCR反應，不加入引物。反應條件：94 ℃預變性2 min，接著94 ℃變性30 s，50 ℃復性1 min，72℃延長1 min，5個循環，最后72 ℃延伸10 min。第三次PCR，以第二次PCR產物為模板，用引物A和D擴增，獲得基因片段HBe（385-420）-LecdCD40L。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，接著94 ℃變性30 s、56.4 ℃復性30 s、72 ℃延長50 s，共30個循環。循環結束后72 ℃延伸7 min后終止反應。回收第三次PCR產物。

1.2.3 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達載體的構建：HBe（385-420）-ecdCD40L基因與pEGFP-N1通過雙酶切（NheI和BamHI）且在T4 ligase作用下連接成pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達載體。

1.3 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L真核表達載體軟件分析 參考林賢凡等[2]的軟件分析方法，融合蛋白的理化性質使用ProtParam tool方案以及DNAStar軟件中的Protean程序進行分析；用www.expasy.org網站提供的Protscale方案和Protean程序進行融合蛋白的柔性分析；應用Protean程序分析其抗原性以及表位；應用www.expasy.org網站提供的HNN方案分析融合蛋白的二級結構。

2 結果

2.1 HBe（385-420）-ecdCD40L 融合基因共714 bp，其PCR結果見圖1。

圖1 PCR擴增出的目的片段，大小為714bp

圖2 質粒pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L經HindIII/BamHI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.2 重組質粒酶切鑒定 所構建質粒 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L經HindIII/BamHI雙酶切后片段大小分別為241 bp和5131 bp，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，片段大小符合（見圖2）。

2.3 測序鑒定 測序結果證明pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L成功構建，融合基因插入方向正確。經DNAman軟件比對，結果顯示，重組質粒中pEGFPN1-HBe（385-420）-ecdCD40L融合基因序列與原設計相符（見圖3）。

圖3 pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L測序

圖4 HBe129-140-ecdCD40L、HBe129-140、ecdCD40L親水性、柔性、抗原性及表位

2.4 融合蛋白HBe（129-140）-ecdCD40L的理化性質分析結果 分子量為25904.4 Da，等電點為8.55，負電荷殘基總數（Asp+Glu）為23，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為26，分子式為C1142H1805N321O347S10，不穩定系數為46.84，該蛋白為不穩定蛋白。通過Protean軟件分析可知HBe（385-420）、ecdCD40L兩個基因連接之后的親水性和疏水性未受影響（見圖4）。

2.5 柔性分析結果 經分析，14到17位氨基酸（linker所在部位）存在高柔性區，連接鏈兩側的柔性區未發生改變（見圖4-5）。

圖5 HBe129-140-ecdCD40L柔性分析

2.6 抗原性分析 結果顯示Linker部位抗原性低，并且兩側HBe（129-140）及ecdCD40L氨基酸序列的抗原性未發生改變（見圖4）。

圖6 HBe129-140-ecdCD40L二級結構

2.7 表位分析結果 通過軟件分析顯示HBe（129-140）-ecdCD40L沒有新的表位出現，14～17位氨基酸表位值低（見圖4）。

2.8 HBe（129-140）-ecdCD40L融合蛋白的二級結構預測結果 提示二級結構由Alpha helix（Hh）為34.33%，Extended strand（Ee）為19.74%，Random coil（Cc）為45.92%構成，linker所在部位基本為無規卷曲，不影響兩側HBe（129-140）和ecdCD40L結構（見圖6）。

3 討論

HBeAg血清轉換是目前抗HBV病毒的治療目標，也是HBV慢性感染進入低或非復制期的標志，可見HBeAg特異性免疫反應一旦獲得，機體內HBV的復制將能得到有效的控制[3]，并且體外HBeAg具有較強的免疫原性，以HBeAg作為免疫原研究乙肝治療性疫苗涉及到如何增強疫苗免疫原性，增強其誘發的HBeAg特異性免疫反應的問題。

HBeAg的優勢T細胞識別表位分別為HBe（120-131）（VSFGVWIRTPPA）和 HBe（129-140）（PPAYRPPNAPIL）；通過Milich等[4]研究證明：相對于HBe（129-140），HBe（120-131）容易誘導免疫耐受，HBe（129-140）作為HBeAg的優勢表位，重要的特點是能夠逃避免疫耐受誘導的同時能夠引起體內自身免疫性反應。

樹突狀細胞（DC）是體內功能最強的專職抗原遞呈細胞，能攝取、加工并遞呈抗原，刺激初始T細胞的增殖、活化從而啟動機體的特異性免疫應答，CD40L信號有助于DC的分化與成熟，反之DC的CD40信號也能促進CD4+T淋巴細胞甚至直接促進CD8+T淋巴細胞的活化與效應功能的產生。經CD40L刺激后的DCs具有如下特性：①DCs抗原遞呈能力增強。②DCs具有較強的T淋巴細胞趨化能力。③DCs體外刺激T淋巴細胞增殖反應能力增強。④DCs表面的共刺激分子（CD80、CD86等）明顯上調，能夠產生較高水平的IL-12、IFN-γ、TNF-α等細胞因子，并使Th0向Th1分化，增強細胞免疫應答[5]。

Li等[6]研究曾發現，將腫瘤相關抗原E7與ecdCD40L基因融合構建腺病毒表達載體，表達的融合蛋白對DC具有明顯刺激作用，且ecdCD40L可增強E7的免疫原性，提示將ecdCD40L與抗原基因融合是切實可行的，且具有明顯的免疫增強效果。結合CD40L可靶向作用于DC，促進DC成熟，誘導T細胞免疫，具有免疫增強作用。鑒于此，本研究將HBe（385-420）基因與CD40L胞外段（ecd）基因融合，構建真核表達載體，ecdCD40L可增強HBe（385-420）免疫原性，誘導更強的特異性T細胞免疫，為乙肝治療性疫苗的研究作準備。

為了確保重組融合蛋白各個部分不會相互干擾而形成非天然構象，本研究引人了linker序列，構建了HBe（385-420）、CD40L胞外段重組表達載體pEGFP-N1-HBe（385-420）-ecdCD40L，通過酶切和測序鑒定載體構建成功，并運用生物信息學軟件對其空間結構和性質進行了預測。通過對重組表達載體的全面分析，促進我們對融合蛋白HBe（385-420）-ecdCD40L更深的認識，并且證實重組體設計的合理性，表達的蛋白生物活性在融合過程中未受影響，這為我們以后基因體內外實驗研究奠定了基礎。

[1] Autran B,Carcelain G,Combadiere B, et al.Therapeutic vaccines for chronic infections[J].Science,2004,305(5681):205-208.

[2] 林賢凡,吳金明,陳瑾,等.乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白的設計和生物活性預測[J].溫州醫學院學報,2009,39(3):205-208.

[3] 閆濤,李梵,王慧芬,等.探討慢性乙型肝炎患者的HbeAg血清轉換[J].軍醫進修學院學報,2011,32(1):21-22,31.

[4] Milich DR, McLachlan A K, Raney AK, et al. Autoantibody production in hepatitis B e antigen transgenic mice elicited with a self T-cell peptide and inhibited with nonself peptides[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(10):4348-4352.

[5] Liu Y,Zhang X,Zhang W, et al. Adenovirus-mediated CD40 ligand gene-engineered dendritic cells elicit enhanced CD8(+) cytotoxic T-cell activation and antitumor immunity[J].Cancer Gene Ther,2002,9(2):202-208.

[6] Zhang L,Tang Y,Akbulut H,et a1.An adenoviral vector cancer vaccine that delivers a tumor-associated antigen/CD40-ligand fusion protein to dendritic cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(25):15101-15106.