大鼠肺成纖維細胞的體外培養及急性炎癥模型的建立

朱天琦，鄭聲星

（1.溫州醫學院附屬第一醫院 麻醉科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫學院附屬第二醫院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見危重病，其病死率極高，大約在40%～70%，由內毒素血癥引起的ARDS極為常見。成纖維細胞作為間質的主要成分，其對炎癥的成功消退過程起到了重要的作用。而在體外培養成纖維細胞并建立其急性炎癥模型是研究成纖維細胞在ARDS過程中促炎癥消退作用的重要方法之一。本研究用不同劑量的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激體外培養的肺成纖維細胞（lung fiibroblasts，LF），并在不同時間點通過細胞毒性檢測來評價內毒素性細胞的損傷程度，旨在建立合理的體外細胞ARDS模型。

1 材料和方法

1.1 動物 SPF級健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠60只，體質量120～150 g，平均（132±10）g由同濟醫學院實驗動物中心提供（醫動字第19-025號）。

1.2 主要試劑 內毒素（LPS，E.coil serotype 055：B5），細胞增殖/毒性檢測試劑（MTT）為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，購自美國sigma公司。用超純水溶解的H-DMEM的培養基（Gibco公司），消化液:0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）。抗波形蛋白（vimentin）單克隆抗體和CD31單克隆抗體，均購自abcam公司。

1.3 LF的分離、培養 參照Tamm等[1]的組織貼壁方法并進行改良，大鼠稱重，腹腔注射2%戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉，仰臥位固定。沿腹中線剪開皮膚、皮下組織，暴露腹腔，切斷腹主動脈放血，剪掉橫膈膜，暴露胸腔，截取胸骨，小心折斷肋骨，摘除胸腺，最大限度地暴露心臟及大血管，從右心室插入套管至肺動脈，用D-Hanks液灌洗至肺明顯發白，完整地取出心肺氣管，除去心臟和大氣道，置于放有預冷的D-Hanks（青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）的無菌培養皿中，反復用預冷的D-Hanks液沖洗，用小剪刀將肺組織剪碎（<1 mm3) ，移至10 mL離心管中， 靜置5 min后，吸去D-Hanks液后加入0.25%胰蛋白酶（37 ℃預溫）5 mL，用吸管反復吹打1.5 min，加入含15%新生牛血清（NBS）的H-DMEM培養液終止消化，用吸管吹打均勻，1000 r/min離心5 min，棄上清，再加入少量15% NBS HDMEM懸浮組織塊，加入培養液以不飄起組織塊為宜。每只大鼠肺可接種一個25 mL的培養瓶。37 ℃、5%CO2培養箱培養，24 h補加培養液后繼續培養，72 h換液。4 d細胞接近融合時，棄去培養液，D-Hanks液輕洗3次，加入0.25%胰酶消化1 min，用含15%NBS的H-DMEM培養液終止消化， 吸管輕輕吹打細胞，收集細胞懸液， 1000 r/min離心2 min，棄上清，用15% NBS的H-DMEM培養液，按1:2接種傳代，40 min后換培養液（差速貼壁法）。LF細胞采用HE染色。

1.4 免疫熒光鑒定 將傳代的LF消化制成單個細胞懸液，計數細胞，調整細胞密度為1×104/mL，接種于6孔板內（孔內有預先置有多聚賴氨酸涂布的蓋玻片），37 ℃、5% CO2培養箱常規培養。當細胞鋪滿蓋玻片時，取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，含0.2% Triton的PBS洗兩次，再PBS洗兩次，5% BSA封閉40 min（室溫），保持濕度，抗孵育過夜（4 ℃）。次日用PBS洗3次，每次5 min，加二抗（避光）室溫孵育1 h，PBS洗7次，每次5 min，Hoechest復染核12 min，PBS洗1次，檢測 LF vimentin和CD31的表達。

1.5 MTT 將分離純化的LF用含15% NBS的培養液配成單個細胞懸液，接種入6孔板，2 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養箱培養，待細胞80%～90%呈融合狀態時，換無血清培養基培養24 h后重懸，調整濃度為1×106個/mL，加入96孔板，100μL/孔，5復孔，同時設空白對照孔（不加細胞），加入不同濃度LPS作為刺激物，建立體外炎癥模型，同時以PBS作為陰性對照。藥物干預時間分別設為3、6和9 h，至規定時間后加入MTT，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4）20μL。繼續于37 ℃、5% CO2培養箱培養孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加150μL DMSO，震蕩10 min，使結晶物充分融解。放入酶標儀檢測，測定波長490 nm各孔的OD值，記錄結果，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.6 統計學處理方法 用SPSS16.0統計軟件進行分析處理。所有數據以±s表示，多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因數方差分析。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnet’s T3檢驗。

2 結果

2.1 LF的分離純化和擴增 24 h后顯微鏡下可見長梭型細胞從組織塊中爬出， 72 h后細胞生長迅速，4 d接近融合。在原代培養過程中，LF還混有少量的圓形II型肺泡上皮（alveolar typeII，ATII）（見圖1），因為傳代后差異貼壁，利用成纖維細胞貼壁的時間早于ATII細胞，從而去除ATII細胞。LF呈星狀或梭形，核橢圓形，核仁明顯，細胞伸出多個突起，并連接成網狀。傳代后的LF幾乎長滿整個培養瓶，偶見其他非纖維細胞（見圖2），細胞增殖能力強，3 d接近融合，連續傳4～5代以后，細胞增殖能力方逐漸下降。

2.2 免疫熒光 肺成纖維細胞vimentin陽性，CD31陰性（見圖3）。

圖1 原代細胞（HE，×200）

圖2 傳代第三代細胞（HE，×200）

圖3 LF vimentin 陽性，CD31陰性

2.3 MTT檢測結果 在LPS的刺激下，大鼠肺成纖維細胞出現了增殖反應，0.1μg/mL組、1μg/mL組、10μg/mL組與對照組相比，均出現了增殖反應（P<0.05）。其中刺激濃度為1μg/mL時，與其他3組相比，細胞增殖反應最大（P<0.05），且在各個濃度的不同刺激時間里，6 h時，細胞增殖反應較大（P<0.05），具體見表1。因此可以確定LPS刺激致ARDS模型的最適刺激濃度為1μg/mL，最佳刺激時間為6 h。

表1 各組不同時間段OD值比較（±s）

表1 各組不同時間段OD值比較（±s）

與其他各組比：aP<0.05；與3h、9h比：bP<0.05

3h 0.206±0.008 0.323±0.007 0.372±0.044a 0.348±0.069組別對照組0.1μg/mL 1μg/mL 10μg/mL 6h 0.199±0.009 0.337±0.009 0.439±0.012ab 0.362±0.009 9h 0.207±0.010 0.337±0.011 0.383±0.007a 0.351±0.011

3 討論

成纖維細胞是人體數量最多的一種間質細胞[2]，主要功能包括細胞外基質的合成與重造、調節上皮細胞的分化、調節炎癥過程以及參與組織損傷的修復[3]。通過調控成纖維細胞可以調控炎癥的發生及消退過程。

本試驗參照Tamm等[1]的組織貼壁方法分離肺成纖維細胞，并進行改良。在分離細胞的過程中發現，分離前使用肝素和經肺動脈、經氣道的充分灌洗非常重要。充分灌洗能沖走心臟和大血管里的大部分血細胞和肺泡內絕大多數的巨噬細胞，這樣可以增加成纖維細胞的純度。而本實驗采用胰酶稍微消化后的組織混合懸液進行貼壁培養的方法，與單純組織培養法[4]相比，單純組織貼壁法缺點為組織存活率低，而且成纖維細胞爬出慢，至少要兩周左右才能有成纖維細胞爬出。同時與差速離心和貼壁法[5]相比，差速離心和貼壁法缺點為酶消化法步驟多，過程復雜，極易污染，成功率很低，而且多次離心也會使細胞損傷和丟失。另外本實驗基本上2代的成纖維細胞純度可達95%～99%。差異貼壁利用成纖維細胞貼壁的時間早于ATII細胞，從而去除ATII細胞。本方法操作簡單， 大大縮短了時間， 全程大約為1 h，減少了污染機會，保證了細胞活力（與組織塊培養法[4]、差速離心和貼壁法[5]相比）。 本實驗還觀察到培養瓶中組織塊分布的均勻度及培養基的量對于成纖維細胞的生長有很大影響，組織塊必須分布均勻而且培養基的量一定要避免組織塊飄起為準。

炎癥是機體抵抗病原入侵、修復組織細胞損傷的重要防御機制之一。傳統觀念認為急性炎癥效應細胞主要有白細胞及巨噬細胞等，目前越來越多證據表明成纖維細胞也可以作為急性炎癥效應細胞[6]。但至今國內外鮮有理想的在體外培養的LF上建立急性炎癥模型。在70%的臨床ARDS病人中，40%與感染及膿毒血癥有關，而細菌內毒素作為自然的致病原是引起ARDS的重要因素[7]。本實驗選擇LPS建立急性炎癥模型較為合理。

MTT可用于簡便而較準確的細胞增殖分析，MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖分析。本試驗是在分離純化得到的成纖維細胞上直接用LPS干預，并利用MTT來檢測細胞增殖高峰所需的LPS的濃度及達到增殖高峰的時間，結果顯示在體外培養的成纖維細胞上用1μg/mL的LPS干預6 h能夠達到增殖的最高峰。本實驗采用原代成纖維細胞建立模型較能表現成纖維細胞病理生理特性，但缺點是LPS直接干預下原代成纖維細胞與在體LPS干預下LF還是有一定區別，因為其不能顯現出成纖維細胞與肺巨噬細胞等的相互作用過程。我們下一步的研究為避免這樣缺點，將采用LPS刺激大鼠，建立大鼠急性肺損傷，并應用免疫磁珠方法急性分離LF，建立急性炎癥LF模型。

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[2] Klapholz-Brown Z, Walmsley GG, Nusse YM,et al. Transcriptional program induced by Wnt protein in human fibroblasts suggests mechanisms for cell cooperativity in defining tissue microenvironments[J]. PLoS One,2007,2(9):e945.

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[6] Vancheri C, Sortino MA, Tomaselli V, et al. Different expression of TNF-alpha receptors and prostaglandin E(2)Production in normal and fibrotic lung fibroblasts: potential implications for the evolution of the inflammatory process[J]. Am J Respir Cell Mol Biol,2000,22(5):628-634.

[7] Udobi KF, Childs E, Touijer K. Acute respiratory distress syndrome[J]. Am Fam Physician,2003,67(2):315-322.