氮磷比對PEI介導BMP-7基因轉染骨髓間充質(zhì)干細胞的影響

嵇曉利，劉勁松，徐海紅，劉傳通，張大風，麻健豐

（溫州醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院 口腔修復科，浙江 溫州 325027）

近年來，基因治療在骨組織工程中受到越來越多的關注。基因治療的關鍵在于如何借助載體將外源基因準確有效地導入靶細胞。基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體雖然轉染效率高，但存在自身難以克服的局限性，如能誘導宿主免疫反應及潛在的致癌性，制備復雜等。而非病毒載體具有安全性高，免疫原性低，易于組裝，體內(nèi)可反復應用等優(yōu)勢，使其在組織工程中應用逐漸增多。陽離子聚合物如聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）、多聚賴氨酸、陽離子脂質(zhì)體等是目前應用最多的非病毒載體類型。1995年Boussif等[1]首次使用PEI作為非病毒載體將DNA有效地轉移到神經(jīng)元細胞。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，PEI可縮合質(zhì)粒DNA，具有特殊的“質(zhì)子海綿效應”，不需溶酶體抑制劑即可轉染細胞。PEI被認為是目前最為有效的非病毒載體之一[2-3]。PEI介導的基因轉染效率受多方面因素影響，其中N/P值（PEI與DNA的氮磷比，即PEI的氨基與DNA的磷酸基團的摩爾比例）對其影響最大[4]。因此，本實驗考察PEI與含骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7基因（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）質(zhì)粒形成的納米復合物N/P值對復合物轉染骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，MSC）表達BMP-7以及細胞毒性的影響，從而篩選出較優(yōu)的轉染條件，為PEI作為非病毒載體在骨組織工程中的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料及儀器 pcDNA3.1-BMP-7質(zhì)粒（由四川大學蔣嬡醫(yī)師惠贈）；大腸桿菌；出生1周SD大鼠；PEI分子量為25 kD，分枝型（Sigma，美國）；質(zhì)粒大量抽提試劑盒（Qiagen公司，德國）；ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；粒徑/Zeta電位測定儀（Malvern，英國）。

1.2 PEI/DNA復合物的制備 BMP-7質(zhì)粒轉化大腸桿菌并按照質(zhì)粒DNA的提取試劑盒操作手冊進行pcDNA3.1-BMP-7質(zhì)粒的大量擴增。精密稱取適量PEI溶于PBS（pH 7.4，150 mmol/L），制得1 mg/mL的儲備液。將儲備液稀釋成0.1 mg/mL的PEI試液，并與質(zhì)粒溶液（0.1 mg/mL）按一定的N/P值（0.5、1、3、5、7、10、20和30）輕搖混合，靜止30 min備用。

1.3 PEI/DNA復合物粒徑及Zeta電位測定 采用粒徑/Zeta電位測定儀測定已經(jīng)制備的納米復合物的粒徑以及Zeta電位值。

1.4 DNA酶（DNase）保護實驗 DNase保護實驗用于檢測復合物抵御DNase消化的能力。按不同的N/P值制備PEI/DNA復合物，每份20μL，分裝于離心管。每管加入4單位的DNA酶1（DNase1）或4μL PBS（對照），37 ℃反應15 min（1單位DNasel的活性指在37 ℃，用時10 min完全消化1 mg DNA所需要的酶量）。反應后，馬上加入100 mmol EDTA，室溫靜置10 min以滅活酶活性。進一步把每份樣品加入肝素鈉溶液（10μL，10μg/mL）或H2O，室溫下靜置2 h，以釋放DNA。重復檢測3次，最后通過凝膠電泳分析PEI對DNA的保護效果。

1.5 細胞毒性實驗 將第三代MSC細胞接種于96孔板，密度5000個/孔，每孔0.2 mL a-MEM培養(yǎng)基，隨后把96孔板置于37 ℃、5% CO2條件下的細胞培養(yǎng)箱中培育24 h使細胞重新貼壁生長。然后將96孔板中的培養(yǎng)基移除，每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基，除了其中3個對照孔外，其余實驗孔加入濃度為7μg/mL的不同N/P值（0.5、1、3、5、7、10、20和30）的PEI/DNA復合物，每N/P值實驗組5個實驗孔。再將96孔板放回細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸取培養(yǎng)液每孔加入100μL內(nèi)含5μg/mL MTT的a-MEM，37 ℃溫育4 h。翻板法棄去液體。每孔加入100μL二甲基亞砜，震蕩10 min，立即于微孔板閱讀器上，在490 nm波長處讀取吸光度值（optical density，OD）均值。以陰性對照組OD值為100%細胞增殖率，計算各組細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR=（各濃度組OD均值/陰性對照組OD均值）×100%。

1.6 轉染效率測定 取第三代的MSCs，以5×103/mL的濃度接種于96孔板中，每孔液量1 mL。待細胞貼壁鋪滿培養(yǎng)板達60%～70%后，分別加入濃度為7 mg/mL的不同N/P值（0.5、1、3、5、7、10、20和30）PEI/DNA復合物，每N/P值實驗組5個實驗孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去除24孔板中的培養(yǎng)基，PBS沖洗孔板，加入細胞裂解液，取裂解后樣品離心，取上清液，4 ℃保存。按照ELISA試劑盒的步驟測定BMP-7的含量。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PEI/DNA復合物的粒徑和Zeta電位 復合物的N/P值從0.5上升到3時，粒徑隨PEI的增加而減小（P<0.05）。而N/P值在3～30的范圍時，復合物的粒徑相對較穩(wěn)定（P>0.05）。N/P值從0.5上升到5時，復合物的Zeta電位從2.10 mV升至31.85 mV。N/P值在5～30范圍時，Zeta電位在30～40 mV波動（見表1）。

2.2 復合物抵御DNase消化的能力 圖1為加入DNase后電泳結果。在N/P值低于3時，泳道中正極方向完全沒有DNA的亮色條帶出現(xiàn)，說明DNA已經(jīng)被DNase完全分解；當N/P值在3至30時，隨著PEI的增加，DNA亮色條帶出現(xiàn)并逐漸增強，說明PEI對DNA的保護功能增強。

表1 不同N/P比形成的PEI/DNA納米顆粒的平均直徑、Zeta電位、MSC的BMP-7表達量

圖1 DNase 1處理后凝膠電泳（電泳圖上方為N/P值）

2.3 復合物對MSC的轉染效率及毒性 N/P值對MSC活力的影響見圖2。當N/P值越小時，即DNA比例越高時，對MSC毒性越小。當N/P值在0.5～10范圍內(nèi)，細胞活力有下降，但相對較小（P>0.05）。當N/P值高于10時，細胞活力下降明顯，細胞毒性增大（P<0.05）。不同N/P值的復合物轉染MSC的BMP-7蛋白質(zhì)表達量見表1。其轉染效率在0.5～7范圍時，隨著N/P值的增加，MSC的BMP-7表達量隨之增加（P<0.05），在N/P=7時達到峰值，其后隨著N/P值增加，BMP-7表達量反而下降（P<0.05）。

圖2 N/P值對MSC活力的影響

3 討論

BMP-7是轉化生長因子超家族的一員，其基因位于人的第20號染色體，分子質(zhì)量約1.6 kb。BMP-7在單獨存在的情況下即可誘導軟骨和骨組織的形成。實驗證明，重組人BMP-7在體內(nèi)和體外都顯示了高效的骨誘導活性，可使多種實驗動物的骨缺損愈合[5-6]。它可促進成骨細胞增殖和堿性磷酸酶的表達，促進MSC增殖，并促使其向成骨細胞分化和誘導體外成骨，被認為具有較強的骨誘導能力，已廣泛用于骨組織工程學[7]。因此，本實驗選擇含BMP-7基因的質(zhì)粒pcDNA3.1作為緩釋基因，為今后基因緩釋組織工程支架材料方面的應用提供實驗基礎。

分枝型PEI及其衍生物類基因傳遞系統(tǒng)的轉基因轉染效率和它們的毒性取決于其分子量、陽離子電荷密度和它們的緩沖能力[8-9]，分枝型PEI的基因轉染效率隨分子量增大而提高，但分子量大時其細胞毒性也隨之增加，25 kD分枝型PEI是其轉染效率和細胞毒性的最佳平衡點，是迄今發(fā)現(xiàn)的轉染效率最高的非病毒載體之一[10]。本實驗選此種材料作為基因載體。

PEI/DNA復合物的表面電荷、粒徑是其體內(nèi)轉染效率的重要影響因素。復合物粒徑大小與PEI的分子量有關，分子量大對DNA壓縮能力強，粒徑小。本實驗顯示PEI與含BMP-7基因的質(zhì)粒形成的納米顆粒直徑在80～200 nm，這與大多數(shù)文獻[11-12]用于體內(nèi)外轉染的復合物的粒徑范圍相似。隨著復合物N/P值的增加，粒徑有減小的趨勢，這是因為隨著PEI量的增加，其對DNA的壓縮能力增強，有利于細胞的吞噬及體內(nèi)逃脫。PEI/DNA復合物表面帶有的正電荷是與表面帶有負電荷的細胞膜結合進而誘導細胞內(nèi)吞或胞飲的前提條件，但Zeta電位過高的復合物不僅毒性大，而且由于容易結合蛋白質(zhì)（主要是白蛋白）或紅細胞，復合物在體內(nèi)較快清除。本實驗結果顯示當復合物的N/P值范圍在5～30時，Zeta電位相對穩(wěn)定，有利于復合物細胞膜結合繼而進入胞內(nèi)，對BMP-7的蛋白質(zhì)表達量的檢測也證實最佳轉染效率在此N/P值范圍內(nèi)出現(xiàn)。轉染效率是檢測基因治療效果最重要的指標，本實驗通過檢測BMP-7的蛋白質(zhì)表達量來測定[13]。轉染復合物N/P值對其轉染效率有極大的影響，在生理pH條件下PEI中的1/5～1/6胺基被質(zhì)子化[14]，并且這些帶正電荷的胺基將與DNA中的負電荷結合形成納米膠體顆粒。當N/P高時，即復合物的凈的正電荷增加時，復合物與細胞的相互作用加強并且增加了細胞與細胞核的吸收能力[15-16]。從結果可以看出，N/P值對轉染效率的影響呈現(xiàn)雙向效應。在N/P值低于7時，轉染效率隨N/P值增加而增加。這是由于隨著PEI的增加，DNA被充分壓縮包裝，更有利于細胞跨越細胞膜障礙。而過高的N/P值反而會導致轉染效率的下降，可能與DNA過度壓縮顆粒過小有關。

PEI的細胞毒性可能是由于其對細胞膜有較高的親合黏附，并且能穿透細胞壁。PEI在細胞膜上可形成2～6 mm的團狀物，低分子量的PEI形成僅10～50 nm的小聚集物，但當PEI與DNA結合后，毒性作用減弱[17]，本研究也證實了這一點。在實驗結果中發(fā)現(xiàn)單純PEI的毒性遠遠大于PEI/DNA復合物的毒性。其可能的原因是含陽離子的聚合物與含有陰離子的DNA結合后，PEI的陽離子與細胞膜的相互作用減弱而細胞產(chǎn)生損傷減少。從實驗結果來看，當N/P值大于10 時，細胞的毒性急劇增加，與其他研究[18]結果相近。

通過以上一系列檢測，我們認為應盡量選擇對細胞毒性小而轉染效率高的參數(shù)。因此在組織工程應用中，N/P值為7～10的PEI/DNA復合物可獲得對骨髓間充質(zhì)干細胞較好的轉染效果。

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