豌豆基因組SSR標記在蠶豆中的通用性分析

摘要：分析了２１對豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）基因組ＳＳＲ引物在１０個蠶豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）品種中的通用性。結果表明，豌豆基因組ＳＳＲ引物在蠶豆中的通用性達３８．１０％，有效引物在蠶豆品種中的多態性比例為１００％。

關鍵詞：豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）；蠶豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）；ＳＳＲ；通用性

中圖分類號：Ｓ６４３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）01－0185-03

Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅａ ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Horsebean

ＨＯＵ Wａｎ－ｗｅｉ，ＬＩＵ Ｙｕ－ｊｉａｏ

（Ｑｉｎｇｈａｉ Ａｃａｄｅｍy ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ＆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｘｉｎｉｎｇ ８１００１６，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ２１ pairs of ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ of ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ） ｉｎ ｈｏｒｓｅｂｅａｎ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ） ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｅａ ＳＳＲ ｉｎ ｈｏｒｓｅｂｅａｎ ｗａｓ ３８．１０％， ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＳＳＲ ｉｎ ｈｏｒｓｅｂｅａｎ ｗａｓ １００％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）； ｈｏｒｓｅｂｅａｎ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）； ＳＳＲ； ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ

簡單序列重復（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ），是一類由１～６個堿基組成的基序（ｍｏｔｉｆ）串聯重復而成的ＤＮＡ序列，它在真核生物的基因組中廣泛存在，其基序兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列［１］。與其他分子標記相比，ＳＳＲ標記具有數量豐富、等位基因變異多、共顯性遺傳、重復性強和對基因組有很好的覆蓋性等特點，已被廣泛應用于基因定位、品種鑒定、圖譜構建、種子純度檢測及遺傳多樣性分析等［２－６］。ＳＳＲ引物的獲得可以通過３條途徑：一是在公共的序列數據庫（ＧｅｎＢａｎｋ）里尋找微衛星序列；二是基因組文庫的篩選；三是從近緣物種中獲得已設計好的引物對［７］。為了降低ＳＳＲ引物的開發成本，近年來很多學者對ＳＳＲ引物在不同種、屬物種間的通用性進行了深入研究［８－１6］。本研究對２１對豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）基因組ＳＳＲ引物在蠶豆中的通用性和多態性進行初步研究，以快速找出可用于蠶豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種等研究的分子標記。

１ 材料與方法

１．１ 試驗材料

供試蠶豆品種為：青海９號、青海１１號、青海１２號、馬牙、陵西一寸、法Ｄ、透心綠、雙“０”、湟飼、１３０。使用ＺＯＮＧ等［１７］報道的２１對豌豆ＳＳＲ引物（表１），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

１．２ ＤＮＡ提取與ＳＳＲ分析

１．２．１ 蠶豆基因組ＤＮＡ提取 取蠶豆幼嫩葉片約１ ｇ，加液氮研磨至粉末狀，加入裝有０．８ ｍＬ ＤＮＡ提取緩沖液［１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）＋１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）＋２．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ＋２％ ＣＴＡＢ＋２％ ＰＶＰ］的１．５ ｍＬ離心管中，６５ ℃水浴４５ ｍｉｎ后加入等體積氯仿／異戊醇（體積比為２４∶１）混勻，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，將上清液轉入另一離心管中，加入等體積無水乙醇。冰上靜置２０ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，棄上清，用７５％乙醇清洗沉淀３次，風干后加入４００ μＬ ＴＥ溶解，－２０ ℃保存備用。

１．２．２ ＰＣＲ反應及產物檢測 ＳＳＲ反應體系（２０ μＬ）包括Ｍｇ２＋ ２ μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１ Ｕ、ｄＮＴＰ各２００ μｍｏｌ／Ｌ、１０ μｍｏｌ／Ｌ上下游引物各２ μＬ、模板ＤＮＡ ２００ ｎｇ。反應程序為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，復性１ ｍｉｎ（６０ ℃起，每循環降低１ ℃），７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，１０個循環；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５０ ℃復性１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，２２個循環；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，４ ℃保存。

擴增產物中加入５ μＬ溴酚藍混勻，取５ μＬ在６％非變性聚丙烯酰胺凝膠中２００ Ｖ恒電壓電泳９０ ｍｉｎ。電泳結束后用蒸餾水漂洗凝膠２次；加入染色液（０．２％ＡｇＮＯ３＋１％冰醋酸＋１０％無水乙醇）銀染１５ ｍｉｎ，然后用蒸餾水漂洗２次；加入顯影液（１．５％ ＮａＯＨ＋０．５％甲醛）進行顯色，記錄結果并分析。

２ 結果與分析

２．１ 豌豆基因組ＳＳＲ引物在蠶豆中的通用性

共有８對豌豆ＳＳＲ引物（ＰＢ１４、ＰＳＡＡ１８、ＰＳＡＤ８３、ＰＳＡＡ４５６、ＰＳＡＤ２８０、ＰＳＡＢ１０９、ＡＤ１００、ＡＡ３０３）可以在蠶豆基因組ＤＮＡ中穩定擴增，占引物總數的３８．１０％。這８對通用性ＳＳＲ引物中有２對來自第７連鎖群（ＬＧ Ⅶ），２對來自第２連瑣群（ＬＧ Ⅱ），１對來自第５連瑣群（ＬＧ Ⅴ） 。這些通用性ＳＳＲ標記所在片段可能是基因組上相對保守的部分，沒有發生遺傳分化；也有可能是兩個物種在進化過程中受到了共同的選擇壓力作用。

２．２ 通用性ＳＳＲ引物在蠶豆品種中的多態性

用８對通用性引物在１０個蠶豆品種的基因組ＤＮＡ中進行擴增（圖１），結果顯示８對引物均表現出多態性，多態性引物比率為１００％。這些多態性引物的等位變異數為３～１０個，平均每對引物有８個等位變異。說明這些引物在蠶豆上有豐富的多態性，可以用于蠶豆資源的遺傳分析。

３ 討論

目前關于ＳＳＲ分子標記在屬內不同物種甚至不同屬物種間的通用性報道很多［８－１７］。利用ＳＳＲ的通用性獲得分子標記，可以提高分子標記開發的效率，降低開發成本，豐富標記數量，這對植物種質資源研究，尤其是構建高密度遺傳圖譜及種質資源的收集、保存和評價都有重要的意義。在對特定物種基因組信息尚未充分了解的情況下，使用其近緣物種的ＳＳＲ引物是一條十分便利的途徑。本研究獲得了８對在豌豆和蠶豆間具有通用性的ＳＳＲ標記，不僅可以用來進行蠶豆種質資源遺傳多樣性分析、基因發掘、鑒定、標記輔助選擇育種等研究，也可以作為蠶豆和豌豆比較基因組學研究等的有效工具。

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