超高效液相色譜法測定柑橘果肉中四種植物性內源激素的含量

摘要：利用超高效液相色譜法同時測定柑橘（Citrus reticulate Bance）果肉中的玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脫落酸的含量。以Ｃ８色譜柱，甲醇－０．１％冰乙酸為流動相梯度洗脫，檢測波長為２６２ ｎｍ，流速０．２２ ｍＬ／ｍｉｎ。結果表明， 玉米素含量在０．１４～０．３８ μｇ／ｍＬ間線性關系良好，Ｒ２為０．９９９ ５，平均回收率為９８．７％，ＲＳＤ為 ０．９９％；赤霉素含量在０．６７～１．７９ μｇ／ｍＬ間線性關系良好，Ｒ２為０．９９９ ３，平均回收率為９８．６％ ，ＲＳＤ為０．７０％；吲哚乙酸含量在０．２５～０．６７ μｇ／ｍＬ間線性關系良好，Ｒ２為０．９９９ ６，平均回收率為９９．０％ ，ＲＳＤ為０．６８％；脫落酸含量在０．０３６～０．０９６ μｇ／ｍＬ間線性關系良好，Ｒ２為０．９９９ ９，平均回收率為９９．１％ ，ＲＳＤ為０．６１％。該方法簡便、快速、精密度高、準確性好，可用于植物樣品中激素含量的測定。

關鍵詞：柑橘（Citrus reticulate Bance）；植物激素；超高效液相色譜法

中圖分類號：Ｏ６５６．２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）01－0165-04

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ Ｏｒａｎｇｅ Ｐｕｌｐ ｂｙ ＵＰＬＣ

ＪＩＡＮＧ Ｙａｎ－ｆａｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｄａｏ－ｐｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｑｉｕ－ｈｏｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｙａｎ

（Ｇｕａｎｇｘｉ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｚｅａｔｉｎ （ＺＴ）， ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ （ＧＡ）， ｉｎｄｏｌｅ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （ＩＡＡ） ａｎｄ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ （ＡＢＡ） was proceeded ｂｙ ＵＰＬＣ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｅｄ ａ Ｃ８ ｃｏｌｕｍｎ， ａｎｄ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｈｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．１％ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ２６２ ｎｍ， ａｎｄ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ ０．２２ ｍＬ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ZT ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．１４ μｇ／ｍＬ and ０．３８ μｇ／ｍＬ， Ｒ２ ｗａｓ ０．９９９ ５， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９８．７％， ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．９９％．Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＧＡ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．６７ μｇ／ｍＬ and １．７９ μｇ／ｍＬ， Ｒ２ ｗａｓ ０．９９９ ３， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９８．６％， ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．７０％．Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ IAA ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．２５ μｇ／ｍＬ and ０．６７ μｇ／ｍＬ， Ｒ２ ｗａｓ ０．９９９ ６， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．０％， ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．６８％． Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＡＢＡ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．０３６ μｇ／ｍＬ～０．０９６ μｇ／ｍＬ， Ｒ２ ｗａｓ ０．９９９ ９， ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．１％， ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．６１％． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｓｉｍｐｌｅ， ｐｒｅｃｉｓｅ， ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｃould ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｏｒａｎｇｅ ｐｕｌｐ（Citrus reticulate Bance）； ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅ； ＵＰＬＣ

植物性內源激素是植物體內合成的對植物生長發育有顯著作用的微量有機物，其生理效應復雜多樣，對植物生長發育有重要的調節控制作用［１，２］。吲哚乙酸、赤霉素、脫落酸、玉米素是植物體廣泛存在的植物激素，本研究運用超高效液相色譜（ＵＰＬＣ）法同時測定柑橘中這４種內源激素，利用ＵＰＬＣ超高分離度、快速、超高靈敏度的優點，解決傳統ＨＰＬＣ在植物激素分析中存在的分離度差，分析時間較長的缺點。本研究建立了植物內源激素高效、穩定、準確的分離和測定方法，為植物內源激素調節其營養生理與生長的研究提供支撐。

吲哚乙酸（ＩＡＡ）是一種植物體內普遍存在的含有一個不飽和芳香族環和一個乙酸側鏈的內源激素，屬吲哚類化合物，又名生長素，其基本作用在于調節植物生長；赤霉素（ＧＡ）是一類屬于雙萜類化合物的植物激素，典型生理作用是能促進枝條的生長，尤其是能促進無傷害植物的整體生長；脫落酸（ＡＢＡ）是一種具有倍半萜結構的抑制生長的植物激素，因能促使葉子脫落而得名，具有加速植物器官脫落，抑制整株植物或離體器官的生長，并對細胞的分裂與生長起抑制等作用；玉米素（Ｚｅａｔｉｎ）是一種天然的細胞分裂素，化學名稱為６－（４羥基－３－甲基－２－反丁烯基）氨基嘌呤，它是從甜玉米灌漿期的子粒中提取并結晶出的第一個天然細胞分裂素，能刺激植物細胞分裂，促進葉綠素形成，加速植物新陳代謝和蛋白質的合成，從而達到有機體迅速增長，促使作物早熟豐產，提高植物抗病抗衰抗寒能力。

１ 材料與方法

１．１ 儀器和試劑

ＡＣＱＵＩＴＹ Ｕｉｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ超高效液相色譜系統，Ｅｍｐｏｗｅｒ色譜工作站，檢測器：ＰＤＡ ｅλ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ紫外檢測器（Ｗａｔｅｒｓ公司）；臺式系列數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

玉米素標準品（Ｓｉｇｍａ公司，純度８７．０％）；赤霉素標準品（ＳＵＰＥＬＣＯ公司，純度９６．５％）；吲哚乙酸（Ｒｉｅｄｅｌ－ｄｅ Ｈａｅｎ公司，純度９９．０％）；脫落酸（Ｓｉｇｍａ公司，純度９９．０％）；甲醇（色譜純）；冰乙酸（分析純）；超純水；Ｃ１８柱（５００ ｍｇ／６ ｍＬ，美國賽分科技公司）。

１．２ 實驗方法

１．２．１ 樣品采集 實驗所用的柑橘樣品均采自廣西全州。在不同時間共采集６組樣品。摘取生長中的柑橘果實，迅速放入冰盒中帶回實驗室，－２０℃保存備用。

１．２．２ 色譜條件 色譜柱：ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＲＢＥＨ１３０ Ｃ８，１．７ μｍ（２．１×５０ ｍｍ）；流動相：甲醇－０．１％冰乙酸梯度洗脫；流速０．２２ ｍＬ／ｍｉｎ；檢測波長為２６２ ｎｍ；柱溫為２５ ℃。

１．２．３ 標準溶液的制備 分別精密稱取玉米素、赤霉素、吲哚乙酸、脫落酸標準對照品０．１２、０．２８、０．２１、

０．１５ ｍｇ置于５０ ｍＬ容量瓶中，５０％甲醇溶解定容，配制濃度分別為２．４、５．６、４．２、３．０ μｇ／ｍＬ的標準儲備溶液。

１．２．４ 樣品溶液的制備 稱取已勻漿的柑橘果肉５．０００ ０ ｇ置于２５ ｍＬ容量瓶中，用８０％甲醇溶解，冰水浴超聲４５ ｍｉｎ，取出恢復常溫后，８０％甲醇定容，過濾，取過濾液１０ ｍＬ于１０ ｍＬ分度比色管，氮吹去除甲醇，殘留液于Ｃ１８柱中脫色，用６．０ ｍＬ流動相分３次洗脫，用１０ ｍＬ分度比色管收集所有從Ｃ１８柱的流出液，流動相定容至８．０ ｍＬ，用０．２２ μｍ有機濾膜過濾，濾液即為待測液。

１．２．５ 四種植物激素混合標準曲線的制備 分別吸取玉米素、赤霉素、吲哚乙酸及脫落酸標準儲備溶液０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６ ｍＬ于６個１０ ｍＬ容量瓶中，流動相定容至刻度，依次進樣，進樣體積為５．０ μＬ。

２ 結果與分析

２．１ 提取方法的確定

據文獻報道，玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脫落酸４種激素可采用６７％的丙酮水溶液［１］、０．５ ｍｏＬ／Ｌ ＮａＯＨ溶液［３］、８０％甲醇水溶液［４］等溶劑提取，石油醚、乙酸乙酯、ＰＶＰ和Ｃ１８柱等方式凈化，根據４種激素對時間和熱不穩定［４］，易發生降解反應，所以在實驗操作過程中應注意控制時間及溫度，本試驗通過對不同的提取溶劑，提取方式（超聲提取、過夜浸提）、提取時間、提取次數分別做單因素考察實驗，最終確定以８０％甲醇為提取劑，冰水浴超聲提取４５ ｍｉｎ，Ｃ１８柱凈化為最佳實驗條件。

２．２ 色譜條件的選擇

２．２．１ 色譜柱的選擇 植物樣品中含雜質量較多，分離難度較大。ＵＰＬＣ選用粒徑低于２ μｍ的小顆粒作為填料，比普通ＨＰＬＣ有更高的分離度、靈敏度和分析速度，因此對分離測定植物樣品中的４種激素具有較大的優勢。本實驗選用ＡＣＱＵＩＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８ １．７ μｍ（２．１×１００ ｍｍ）、ＡＣＱＵＩＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８ １．７ μｍ（２．１×５０ ｍｍ）和ＡＣＱＵＩＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ μｍ（２．１×５０ ｍｍ）分別對樣品進行分離測定，結果顯示用ＡＣＱＵＩＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８ １．７ μｍ（２．１×５０ ｍｍ）能夠對樣品進行很好的分離。

２．２．２ 波長的選擇 將４種激素的混合標準溶液于ＡＣＱＵＩＴＹ超高效液相色譜系統上進行測定，ＰＤＡ紫外檢測器對其進行光譜掃描，最大吸收光譜的波長分別為：玉米素（ＺＴ）在２０４ ｎｍ和２７１ ｎｍ有吸收峰，赤霉素（ＧＡ）在１９２ ｎｍ和２５２ ｎｍ有吸收峰，吲哚乙酸（ＩＡＡ）在２１８ ｎｍ和２７９ ｎｍ有吸收峰，脫落酸（ＡＢＡ）在１９４ ｎｍ和２６１ ｎｍ有吸收峰。將４種激素的混合標準液分別在以上多個波長下進行測定，發現在波長為２６２ ｎｍ下標準混合液出峰基線毛刺少且峰形較好，玉米素、吲哚乙酸和脫落酸的峰面積為最高，赤霉素峰面積也變化較少，所以本實驗采用２６２ ｎｍ為４種激素的檢測波長。４種激素的吸收光譜圖見圖１。

２．２．３ 流動相的選擇 根據４種激素的特性及植物樣品所含的雜質量，通過對各種流動相如甲醇－水、乙腈－水、甲醇－乙酸－水、乙腈－乙酸－水等不同溶液系統的嘗試，最終選用甲醇和０．１％冰乙酸－水溶液為流動相。經反復試驗后，發現甲醇和０．１％冰乙酸－水溶液在梯度洗脫的條件下，各組分分離較好，且各峰峰型較好，分析時間也較短。４種激素保留時間合適，色譜圖見圖２；流動相比例見表１。

２．３ 線性關系

以對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，將所得數據繪成標準曲線，玉米素線性方程為：Ｙ＝５９３．８１０Ｘ－４３．４６９，Ｒ２=０．９９９ ５，線性范圍０．１４～０．３８ μｇ／ｍＬ；赤霉素線性方程為：Ｙ＝４８．９４８Ｘ－１９．１０５，Ｒ２=０．９９９ ３，線性范圍０．６７ ～１．７９ μｇ／ｍＬ；吲哚乙酸線性方程為：Ｙ＝３１５．５００Ｘ－４３．４７１，Ｒ２=０．９９９ ６，線性范圍０．２５～０．６７ μｇ／ｍＬ；脫落酸線性方程為：Ｙ＝６ ４８１．０００Ｘ－１３６．６１０，Ｒ２=０．９９９ ９，線性范圍０．０３６～０．０９６ μｇ／ｍＬ。結果見圖３－圖６。

２．４ 精密度試驗

精密吸取玉米素、赤霉素、脫落酸和吲哚乙酸混合標準溶液各５．０ μＬ，重復進樣５次，測定峰面積，玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脫落酸標準溶液峰面積的ＲＳＤ分別為０．３９％、０．４７％、０．２９％、０．２５％。表明方法精密度良好。

２．５ 重復性試驗

同一批柑橘樣品取樣５份，按１．２．４操作，依法測定，計算玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脫落酸的含量，ＲＳＤ分別為３．６４％、２．４８％、２．７８％、３．１５％。表明方法重復性良好。

２．６ 回收率試驗

稱取已知含量的樣品９份，加入玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脫落酸標準溶液５．０、７．５、１０．０ ｍＬ各３份，按１．２．４進行操作測定，計算回收率，結果（表２-表５）表明，回收率在９８．６％～９９．１％，ＲＳＤ在０．６１％～０．９９％，表明方法回收率較好。

２．７ 樣品測定結果

對柑橘樣品進行分析，每批樣品重復測定５次，結果取平均值，結果見表６。

３ 小結與討論

以８０％甲醇為提取劑，冰水浴超聲提取４５ ｍｉｎ，Ｃ１８柱凈化為最佳實驗條件，甲醇和０．１％冰乙酸為流動相，流速０．２２ ｍＬ／ｍｉｎ梯度洗脫，ＵＰＬＣ系統對樣品進行測定，樣品中４種激素能在７ ｍｉｎ之內達到較好的分離。充分利用了超高效液相色譜的優點與有利條件，建立的方法簡單可靠，進一步拓寬了液相色譜在植物激素測定方面的應用。

參考文獻：

［１］ 劉賢明，梁錦添，秦緒雄．用高效液相色譜分析植物內源激素吲哚－３－乙酸、脫落酸和玉米素［Ｊ］．色譜，１９９６，８（１）：３４０－３４１．

［２］ 陳小鵬，王秀峰，孫小鐳，等．高效液相色譜測定黃瓜瓜條中赤霉素和脫落酸含量［Ｊ］．山東農業科學，２００５（１）：６５－６７．

［３］ 鄭春霞，王 強，阮 曉．ＨＰＬＣ分離測定香梨三種植物激素［Ｊ］．新疆農業大學學報，２０００，２３（１）：５４－５６．

［４］ 陳波浪，鄭春霞，盛建東，等． ＨＰＬＣ分離和測定棉花中３種植物激素［Ｊ］．新疆農業大學學報，２００６，２９（１）：２８－３０．