表達序列標簽研究進展及其在甲殼動物中的應用概況

表達序列標簽研究進展及其在甲殼動物中的應用概況

（1.中國石油天然氣管道工程有限公司，河北 廊坊 065000；2.南昌大學，ａ．食品科學與技術國家重點實驗室；

ｂ．生命科學與食品工程學院，南昌 ３３００３１）

摘要：隨著生物信息學的發展，表達序列標簽（ＥＳＴ）在分子標記開發、新基因分離鑒定、基因表達譜分析、基因組功能注釋、基因電子克隆等方面具有重要作用。簡要介紹了ＥＳＴ分析的原理及其在基因識別、基因預測、物理圖譜的構建、ＤＮＡ芯片制備等方面的應用概況。綜述了甲殼動物ＥＳＴ的研究現狀，并對ＥＳＴ的應用前景進行了展望。

關鍵詞：表達序列標簽（ＥＳＴ）；甲殼動物；生物信息學

中圖分類號：Ｑ９５９．２２３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）01－0001-04

Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｄｖａｎｃｅ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ（ＥＳＴ） ａｎｄ Its Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ

QI Ｊi－bin1，ＺＨＡＯ Ｄａ－ｘｉａｎ2ａ，2ｂ

（1. China Petroleum Pipeline Engineering Limited Corporation Langfang 065000，Hebei，China；2ａ． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；2ｂ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００３１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ （ＥＳＴ） played ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ iｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｎｅｗ ｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｇｅｎｏｍｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｌｉｃｏ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ． Tｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ＥＳＴ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ iｎ ｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｇｅｎｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ， ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ was briefly introduced． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ ＥＳＴ ａｎｄ the ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｆ ＥＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ（ＥＳＴ）； ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ； ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ

表達序列標簽（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ，ＥＳＴ）是從一個隨機選擇的ｃＤＮＡ克隆進行５’端和３’端單一次測序獲得的短的ｃＤＮＡ部分序列。一個基因轉錄本的ｃＤＮＡ序列可能包含有多個序列重疊的ＥＳＴ，而一個基因ｍＲＮＡ剪接點不同可以獲得多個ｃＤＮＡ克隆，因此ＥＳＴ既可能對應于一個ｃＤＮＡ的某一部分，又可能代表ｍＲＮＡ的不同剪接方式。此外，由于ＥＳＴ來源于一定環境下某種組織總ｍＲＮＡ所構建的ｃＤＮＡ文庫，故ＥＳＴ也能說明該組織中各基因的表達水平及特異性。將所獲序列與基因數據庫中的已知序列進行比較，可以獲得對生物體生長發育、繁殖分化、遺傳變異、衰老死亡等一系列生命過程相關的基因。

近年來，隨著ＥＳＴ計劃在不同物種間的展開和研究內容的深入，來源于不同物種、不同組織、不同細胞類型和不同發育階段的表達基因序列的數目急劇上升。到２００３年６月，美國國家生物技術信息中心（ＮＣＢＩ）的ＥＳＴ數據庫（ｄｂＥＳＴ）（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）中已錄入的來自不同物種的不同組織的ＥＳＴ共有１７ ２９１ １２３條，到２００６年１０月，ＮＣＢＩ數據庫中的ＥＳＴ共有３８ ９５３ １７８條，到２００９年３月，ＮＣＢＩ數據庫中的ＥＳＴ增至

６０ ５０８ ９１５條，其中有關人和鼠的最多。

１ 表達序列標簽的應用

隨著基因組學的發展，ＥＳＴ技術已被廣泛應用于分子標記、分離鑒定新基因、基因表達譜分析、基因組功能注釋、基因電子克隆、制備ＤＮＡ芯片、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）技術的研究、尋找其他序列特征等研究領域。

１．１ 基因識別

ＥＳＴ已經被廣泛應用于基因識別，因為ＥＳＴ的數目比ＧｅｎＢａｎｋ中其他的核苷酸序列多，研究人員更容易在ＥＳＴ數據庫中搜尋到新的基因。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ等［１］通過果蠅黑胃Ｔｏｌｌ蛋白進行ｄｂＥＳＴ數據庫檢索，該蛋白已被證實在成熟果蠅抗真菌反應中發揮重要作用，通過同源分析的方法，找到相應的人類同源ＥＳＴ，這為接下來研究人類Ｔｏｌｌ同源蛋白的功能提供了很好的基礎。

１．２ 基因預測

由于ＥＳＴ來源于ｃＤＮＡ，因此每條ＥＳＴ均代表了文庫建立時所采樣品特定發育時期和生理狀態下的一個基因的部分序列。使用合適的比對參數，大于９０％的已經注釋的基因都能在ＥＳＴ數據庫中檢測到［２］。ＥＳＴ可以作為其他基因預測算法的補充，因為它們對預測基因的交替剪切和３’端非翻譯區很有效。

Ｂｏｕｌｔｗｏｏｄ等［３］通過對已有的ＥＳＴ數據庫進行分析，得到了一個與５號染色體長臂缺失綜合癥相關的基因，并確定是二氫嘧啶酶相關蛋白家族的一個新成員。由于人類和小鼠的序列相似性較高，因此Ｂｕａｎｎｅ等［４］利用小鼠發育相關基因的序列搜尋人的ＥＳＴ數據庫，發現了一個人的ＰＣ４同源基因，被命名為干擾素相關發育調節因子１，而且通過相似性比較確定了一個已知基因ＳＫＭｃ１５也是屬于基因家族的成員，由此獲得了一個新的發育相關基因家族。

１．３ 物理圖譜的構建

ＥＳＴ可以借助于序列標簽位點（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅｓ，ＳＴＳ）用于基因圖譜的構建。ＳＴＳ本身是從人類基因組中隨機選擇出來的長度為２００～３００ ｂｐ的經ＰＣＲ檢測的基因組中惟一的一段序列。來自ｍＲＮＡ的３’端非翻譯區的ＥＳＴ更適合作為ＳＴＳ用于基因圖譜的繪制，這主要是由于其沒有內含子的存在，因此在ｃＤＮＡ及基因組模板中，其ＰＣＲ產物的大小相同，另外，與編碼區具有很強的保守性不同，３’端非翻譯區序列的保守性較差，因此很容易將單個基因與編碼序列關系非常緊密的相似基因家族成員分開［５］。利用的３’端非翻譯區序列和體細胞雜交技術，已經成功構建了人類基因組的部分遺傳和物理圖譜［６］。

１．４ 基因表達譜分析

因為ＥＳＴ序列是從某特定組織的ｃＤＮＡ文庫中隨機測序而得到的，所以可以利用未經標準化和差減雜交的ｃＤＮＡ文庫ＥＳＴ分析特定組織的基因表達譜。標準化的ｃＤＮＡ文庫和經過差減雜交的ｃＤＮＡ文庫則不能反應基因表達的水平。

為了研究癌癥的分子機理，美國國家癌癥研究所（ＮＣＩ）的癌癥基因組解析計劃（Ｃａｎｃｅｒ gｅｎｏｍｅ aｎａｔｏｍｙ pｒｏｊｅｃｔ，ＣＧＡＰ）構建的很多正常的或是癌癥前期的和癌癥后期的組織的ｃＤＮＡ文庫，并進行了大規模的ＥＳＴ測序，其中大部分的文庫未經標準化或差減雜交處理。

Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ等［７］對利用ＥＳＴ進行基因表達分析的方法進行了改進，他們開發了通量更高的基因表達連續分析方法（ＳＡＧＥ），它是一種用于定量、高通量基因表達分析的試驗方法，原理就是分離每個轉錄本特定位置的較短的單一序列標簽（９～１４個堿基對），這些短的序列被連接、克隆和測序，特定的序列標簽的出現次數就反映了對應基因的表達豐度。

１．５ 基因的電子克隆

電子克隆技術是以算法為核心，以計算機和互聯網為工具，利用現有的ＥＳＴ和生物信息數據庫，對其中大量ＥＳＴ進行分類、整合、組裝，直接獲得大片段或ｃＤＮＡ全長的方法。ＥＳＴ數據庫的迅速擴張，使利用其來識別與克隆新基因迅猛發展起來。陳大福等［８］以果蠅腺苷酸轉移酶基因ｃＤＮＡ序列作為模板，對家蠶ＥＳＴ數據庫進行同源檢索篩選，克隆出家蠶腺苷酸轉移酶基因的ｃＤＮＡ序列。通過ＥＳＴ分析，還可用于預測基因結構［９］，挖掘ｍＲＮＡ加工和成熟的分子機制（如ｍＲＮＡ加工信號元件、可變剪接和３’末端加工的多樣性等）［１０］及存在于同一物種個體之間的單核苷酸多態性（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）信息［１１］。近來，將ＥＳＴ結合其他技術還可用于蛋白的鑒定，Ｅｄｗａｒｄｓ［１２］運用ＥＳＴ及序列數據庫壓縮的方法找到了一種迅速而有效鑒別蛋白的新方法。正是由于ＥＳＴ表現出了這些巨大潛能，才使其得到了充分的利用與發展。

１．６ ＤＮＡ芯片的制備

高密度寡核苷酸ｃＤＮＡ芯片或ｃＤＮＡ微陣列是一種新的大規模檢測基因表達的技術，具有高通量分析的優點。在許多情況下，ｃＤＮＡ芯片的探針來源于３’ＥＳＴ［１３］，所以ＥＳＴ序列的分析有助于芯片探針的設計。隨著更多基因組計劃的實施和更多已知功能基因的累積，將來無需測序，只要通過ＤＮＡ芯片技術就可研究基因功能。ＥＳＴ計劃的實施不僅獲得了關于表達基因的信息資源，同時也獲得了大量已鑒定的ｃＤＮＡ克隆資源，而這些資源都是功能基因組學研究不可缺少的。

２ 甲殼動物ＥＳＴ的研究概況

至２００９年３月，ＮＣＢＩ的ＥＳＴ數據庫中已錄入的來自不同物種的不同組織的甲殼動物ＥＳＴ序列共有６７８ ５８５條，其中十足目種類有３６７ １３８條，所涉及的種類和ＥＳＴ數目見表１。

ＥＳＴ技術在蝦蟹等甲殼動物中的應用主要集中在基因的識別、預測、分子標記的開發以及基因表達圖譜的構建上。Ｔａｓｓａｎａｋａｊｏｎ等［１４］對斑節對蝦進行了大規模的ＥＳＴ測序分析，通過構建正常生理和脅迫條件下眼柄、肝胰腺、造血組織、血細胞、淋巴組織和卵巢ｃＤＮＡ文庫，對１０ １００個克隆進行５’端單向測序，獲得了４ ８４５條高質量的ＥＳＴ序列，發現了大量與免疫相關及組織特有的ＥＳＴ序列，如在眼柄ｃＤＮＡ文庫中發現了兩類該組織特有的ＥＳＴ序列——蛻皮抑制激素基因（ＭＩＨ）和色素擴散激素基因（ＰＤＨ），這兩種基因對蛻皮、生殖、血糖濃度變化和色素遷移等生理活動具有重要的調節作用，是甲殼動物的神經分泌中心。這兩類基因在Ｙａｍａｎｏ等［１５］對日本囊對蝦（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）眼柄ｃＤＮＡ進行的ＥＳＴ分析中也被發現。另外，通過對斑節對蝦（Penaeus mondon）ＥＳＴ的進一步分析，獲得了９９７條微衛星序列。同時，Ｍａｎｅｅｒｕｔｔａｎａｒｕｎｇｒｏｊ等［１６］基于以上研究，通過ＥＳＴ技術，構建了斑節對蝦的基因連鎖圖譜。Ｄｏｎｇ等［１７］通過對中國明對蝦（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）的ＥＳＴ分析，發現了許多與免疫相關的基因，包括不同類型的抗菌肽基因（如對蝦素、抗脂多糖因子等）、酚氧化酶系統相關基因（如酚氧化酶酶原、絲氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑等）、凝集相關基因（凝集素、轉谷氨酰胺酶等）、信號傳導相關基因（Ｐｅｒｏｘｉｎｅｃｔｉｎ、整合素等）。Ｇｒｏｓｓ等［１８］對凡納濱對蝦（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ）和白濱對蝦（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｓｅｔｉｆｅｒｕｓ）ＥＳＴ進行了詳細的比較分析，也得到了２６８條可能編碼４４種免疫相關基因的序列。Ｗｕ等［１９］對日本沼蝦（Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｅ）進行了ＥＳＴ分析，獲得了３ ２５６條高質量的ＥＳＴ序列，通過分析發現了２８個可能參與蝦卵巢發育相關的基因。Ｃｏｂｌｅｎｔｚ等［２０］對藍蟹（Ｃａｌｌｉｎｅｃｔｅｓ ｓａｐｉｄｕｓ）鰓和皮下組織的ｃＤＮＡ文庫進行了分析，獲得了１１ ７６１條高質量的ＥＳＴ序列。Ｌｉ等［２１］通過ＥＳＴ技術對草蝦（Ｐａｌａｅｍｏｎｅｔｅｓ ｐｕｇｉｏ）的表達圖譜進行了分析，結果發現，有些含ＥＳＴ的基因對脅迫因子具有特異性，比如，肌肉蛋白和谷胱甘肽過氧化物酶分別對草蝦在慢性暴露和缺氧條件下表現為上調作用，而與硫氧化還原作用和半胱氨酸代謝相關的基因在缺氧條件下則表現為下調作用。Ｊｉａｎｇ等［２２］對中華絨螯蟹（Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）肝胰腺的ｃＤＮＡ文庫ＥＳＴ序列進行了詳細的分析，對３ ２９７條高質量ＥＳＴ序列進行拼接后，共獲得１ １７８個可能的基因，將這些基因與ＮＣＢＩ數據庫進行比對后發現５７２個基因獲得了功能注釋，６０６個未能注釋。通過功能分析發現了大量與免疫和代謝相關的基因序列，包括可能編碼抗菌肽、絲氨酸蛋白酶及其抑制劑、應激蛋白及抗氧化系統相關的基因等。Ｚｈａｏ等［２３］對中華絨螯蟹血細胞ｃＤＮＡ文庫ＥＳＴ序列進行分析，共獲得了１ ０３９個可能的基因，其中４８８個獲得了功能注釋，同時發現了２６條與免疫相關的基因序列，包括參與凝集系統、酚氧化酶系統、抗氧化酶系統、抗菌肽及模式識別分子相關的基因等。

以上信息可以用來分離并研究中華絨螯蟹各項生理活動相關的重要基因及其表達，為進一步利用這些基因打下基礎。這些組織特異性文庫的構建為中華絨螯蟹功能基因的克隆提供了良好的技術平臺和資源儲備。

３ 展望

由于ＥＳＴ數據庫中包含著豐富的分子生物學信息，使其在新基因克隆中展現出明顯的優勢。隨著基因組學研究的深入和基因定點突變技術、定向重組技術、基因表達ＤＮＡ芯片技術和蛋白質組計劃的發展，ＥＳＴ將在大規模基因識別、克隆和表達分析方面起到更加顯著的作用。比較不同的ＥＳＴ數據，結合試驗方法還可獲得ＳＮＰ，可以構建更為個性化的基因圖譜。這些研究提供的資料將豐富和發展生物信息學，人們將開發模式生物，甚至在芯片上進行“雜交”作圖，定位與復雜疾病相關的基因，這將使基因組研究進入一個全新的階段。

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［１８］ ＧＲＯＳＳ Ｐ Ｓ， ＢＡＲＴＬＥＴＴ Ｔ Ｃ， ＢＲＯＷＤ Ｙ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｅ ｇｅｎｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｍｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｃｉｆｉｃ ｗｈｉｔｅ ｓｈｒｉｍｐ， ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｔｌａｎｔｉｃ ｗｈｉｔｅ ｓｈｒｉｍｐ， Ｌ． ｓｅｔｉｆｅｒｕｓ［Ｊ］． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００１， ２５（７）：５６５－５７７．

［１９］ ＷＵ Ｐ， ＱＩ Ｄ， ＣＨＥＮ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ａｎ ｏｖａｒｙ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｏｒｉｅｎｔａｌ ｒｉｖｅｒ ｐｒａｗｎ Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｅ ｂｙ ＥＳＴｓ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｄ： Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ２００９， ４（２）：１１１－１２０．

［２０］ ＣＯＢＬＥＮＴＺ Ｆ Ｅ， ＴＯＷＬＥ Ｄ Ｗ， ＳＨＡＦＥＲ Ｔ Ｈ． Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｆｒｏｍ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ｇｉｌｌ ａｎｄ ｈｙｐｏｄｅｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｕｅ ｃｒａｂ， Ｃａｌｌｉｎｅｃｔｅｓ ｓａｐｉｄｕｓ ［Ｊ］. Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｄ：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００６，１（２）：２００－２０８．

［２１］ ＬＩ Ｔ Ｄ， ＭＡＲＩＵＳ Ｂ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｆｒｏｍ ｇｒａｓｓ ｓｈｒｉｍｐ ｐａｌａｅｍｏｎｅｔｅｓ ｐｕｇｉｏ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｅｓｓｏｒｓ［Ｊ］． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｄ： Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００９，４（３）：１８７－１９５．

［２２］ ＪＩＡＮＧ Ｈ， ＣＡＩ Ｙ Ｍ， ＣＨＥＮ Ｌ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓ ｏｆ ｍｉｔｔｅｎ ｃｒａｂ （Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ） ［Ｊ］． Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００９，１１（３）：３１７－３２６．

［２３］ ＺＨＡＯ Ｄ Ｘ， ＳＯＮＧ Ｓ Ｈ， ＷＡＮＧ Ｑ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｉｔｔｅｎ ｃｒａｂ （Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ） ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈａｅｍｏｃｙｔｅｓ ［Ｊ］． Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００９，２８７（３－４）：２９７－３０３．