轉ipt基因四季海棠植株抗旱性分析

摘要：利用ｉｐｔ重組表達載體質粒，通過農桿菌介導法建立了遺傳轉化體系，并篩選出四季海棠（Ｂｅｇｏｎｉａ ｓｅｍｐｅｒｆｌｏｒｅｎｓ）轉ｉｐｔ基因植株。研究結果發現，在細胞分裂素的調控下，轉基因植株的高度、葉片面積均有不同程度的減小，但根系長度增加；在滲透脅迫條件下，轉基因植株體內脯氨酸含量和ＳＯＤ活性都明顯增加。通過溫室栽種，發現在同等情況下轉基因植株的耐旱性明顯強于非轉基因植株。

關鍵詞：四季海棠（Ｂｅｇｏｎｉａ ｓｅｍｐｅｒｆｌｏｒｅｎｓ）；異戊烯基轉移酶基因（ｉｐｔ）；細胞分裂素；遺傳轉化體系；抗旱性

中圖分類號：Ｓ６６１．４；Ｑ９４５．７８ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）01－0083-05

Analysis on Drough Tolerance of Transgenic Begonia semperflorens Plant

with ipt Gene

ＺＨＡＮＧ Ｌｅｉ，ＢＡＯ Ｐｉｎｇ－ｑｉｕ

（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００７５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｐｔ（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ） ｉｓ ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ． Tｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｐｔ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｂｅｇｏｎｉａ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ， ｔｈｅ ｈｅｉｇｈｔ， ｌｅａｆ ａｒｅａ ａｎｄ ｌｅａｆ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｇｒｅｅｓ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ （ＳＯＤ） ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｌｉｎｅ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅd ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ ｕｎｄｅｒ ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ （ＰＥＧ） ６０００． Ｔｈｅ ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｅｇｏｎｉａ ｓｅｍｐｅｒｆｌｏｒｅｎｓ； ｉｐｔ； Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ system； ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ

四季海棠（Ｂｅｇｏｎｉａ ｓｅｍｐｅｒｆｌｏｒｅｎｓ）屬于秋海棠科（Ｂｅｇｏｎｉａceae）秋海棠屬（Ｂｅｇｏｎｉａ Ｌ.），該屬是秋海棠科中最大的屬，包含１ ０００多種，主要分布于熱帶和亞熱帶地區，以中、南美洲分布最多，在我國南方各省分布較多，約１４０種［１］。四季海棠因其花色豐富、葉色多樣，具有很高的觀賞性，被廣泛應用在花壇以及擺花中。

人們利用ｉｐｔ基因在葉片抗衰老和抗逆性方面開展了大量的工作。Ｇａｎ等［２］首次利用來自擬南芥葉片的衰老特異表達啟動子ＰＳＡＧ１２和ｉｐｔ基因構建了葉片ＣＴＫs生物合成自動調控系統，即ＰＳＡＧ１２－ｉｐｔ嵌合基因。將該嵌合基因轉入煙草中，當植株葉片開始成熟時，ＰＳＡＧ１２啟動，ｉｐｔ基因表達，ＣＴＫｓ 含量增加，葉片衰老延緩。科研人員將ｉｐｔ基因轉入水稻、高羊茅、菊花、非洲菊等植物，均發現轉基因植株的葉綠素含量、抗衰老能力有了顯著提高［3-６］。Ｒivero等［７］在轉ｉｐｔ基因煙草的研究中還發現，轉基因煙草在干旱脅迫條件下，經細胞分裂素的誘導，過氧化體中過氧化氫酶含量增強了，同時線粒體、葉綠體、過氧化體之間依然保持緊密聯系，這些變化促進了光呼吸作用，提高了植物的抗旱能力。以轉ｉｐｔ基因四季海棠為研究對象，從其形態變化、生理特點等方面，探討其抗旱的生理機制，為培育更多抗旱花卉植物打下一定的基礎。

１ 材料與方法

１．１ 材料

所用材料為通過農桿菌轉化獲得的轉ｉｐｔ基因四季海棠。

１．２ 方法

１．２．１ 滲透脅迫處理 滲透脅迫處理是在等滲溶液中加入不同質量的ＰＥＧ ６０００，濃度分別為０、２０％、４０％（m／Ｖ），并將ｐＨ調整為６．０。葉圓片在帶蓋的培養皿中培養，每個培養皿倒入２０ ｍＬ不同濃度的ＰＥＧ ６０００溶液，同時放入２０個葉圓片。光照培養，光照度１３０ ｌｘ，溫度２０ ℃，連續培養２０ ｈ，并不時地搖晃。

１．２．２ 脯氨酸含量的測定 脯氨酸的測定采用水合茚三酮的方法。

１）標準曲線制作。用脯氨酸配制不同濃度的溶液，在沸水中加熱４０ ｍｉｎ，冷卻后加入５ ｍＬ甲苯，充分振蕩，萃取紅色物質。分層后吸取甲苯層，在波長５２０ ｎｍ處測定吸光值。

２）脯氨酸提取及含量測定。取０．３ ｇ葉片，剪碎放入試管，加入５ ｍＬ ３％的磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃塞，于沸水中浸提１０ ｍｉｎ，室溫冷卻，過濾。取上清液，加入２ ｍＬ酸性水合茚三酮（１．２５ ｇ水合茚三酮加入３０ ｍＬ 冰乙酸和２０ ｍＬ ６ mol/L的磷酸）和２ ｍＬ冰乙酸，在沸水中水浴３０ ｍｉｎ，然后冰上冷卻。加入 ４ ｍＬ甲苯振蕩，在黑暗處靜置２ ｈ，以萃取紅色物質。待分層后用吸管吸取甲苯層，測定波長５２０ ｎｍ處的吸光值。重復測定３次。

脯氨酸含量＝（Ｃ×ＶＴ／Ｖ１）／ｍ

Ｃ為提取液中脯氨酸濃度（μｍｏｌ／Ｌ），由標準曲線求得；ＶＴ為提取液總體積（ｍＬ）；Ｖ１為測定時所吸取的體積（ｍＬ）；m為樣品質量（ｇ）。

１．２．３ 超氧化物歧化酶活性測定 超氧化物歧化酶活性測定采用氮藍四唑法。

１）酶液提取。取植物葉片０．５ ｇ 于預冷的研缽中，加２ ｍＬ 預冷的提取介質（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．８ 的磷酸緩沖液，內含１％ 聚乙烯吡咯烷酮），在冰浴下研磨成勻漿，加入提取介質沖洗研缽數次，并使終體積為 １０ ｍＬ。取５ ｍＬ于４ ℃下１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心15 min，吸取上清液即為 ＳＯＤ酶液。

２）酶反應體系的制備。具體按表1配制。

３）顯色反應。將上述溶液混勻加入試管，一支試管用雙層黑色硬紙套遮光，作為對照；其余放置于４ ０００ ｌｘ日光燈下反應２０~３０ ｍｉｎ，反應溫度２５～３５ ℃。當出現顏色變化后，終止反應。

４）ＳＯＤ活性測定和計算。反應結束后，以遮光處理的試管作為空白，分別在５６０ ｎｍ波長下測定各管的吸光度。

５）計算公式：

ＳＯＤ活性＝［（Ａ０－ＡＳ）×ＶＴ］／［Ａ０×０．５×ＦＷ×Ｖ１］

ＳＯＤ比活力＝ＳＯＤ活性／蛋白質濃度

式中，Ａ０為空白管的吸光值，ＡＳ為樣品管的吸光值，ＶＴ為樣品總體積（ｍＬ），ＦＷ為樣品鮮重（ｇ），Ｖ１為測定時樣品用量（ｍＬ）。

２ 結果與分析

２．１ 轉基因四季海棠生物特性

把經ｋａｎ抗性篩選、ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印跡雜交等方法鑒定為轉基因的２１株四季海棠進行編號，分為２１個組。為了進一步探討轉基因植株的抗旱性，對各組進行擴繁，獲得大量轉基因植株種植在溫室中。經過２個月的栽培和初步篩選，選取其中生長情況較好的５個組進行抗旱研究。

從每組選取１０株植株進行測定，統計結果如圖１。從圖１可以看出，轉基因植株根長和Ｒ／Ｔ值分別增長了３８％和７３％，而植株高度和葉片面積有不同程度下降。說明植物體內細胞分裂素的作用是抑制頂端優勢、促進側芽的生長。

轉基因四季海棠根系發達，長度明顯長于普通植株，根冠比大，這些特點顯示出轉基因植株具有發達的根系，較強的吸水能力，與其良好的抗旱性能相一致。

２．２ 葉綠素含量的變化

從每組植株中選取２０片葉片，用８０％丙酮提取葉綠素，然后用分光光度計測定其含量，結果如圖２。從圖２可以看出，對照植株中葉綠素ａ平均含量為０．０８９ ５ ｍｇ／ｇ，轉基因植株的平均含量為０．４４６ ７ ｍｇ／ｇ；對照植株葉綠素ｂ平均含量為０．０７１ ７ ｍｇ／ｇ，轉基因植株的平均含量為０．２０９ ５ ｍｇ／ｇ。同時數據分析顯示，所測轉基因樣品的差異度較大，反映出該基因在不同植株體內的表達不穩定，這可能與基因插入的位置及拷貝數有關。轉基因植株葉片中葉綠素含量明顯增加，證實了細胞分裂素具有保綠的作用。

２．３ 葉片氣孔的變化

通過對葉片氣孔的觀察發現轉基因植株的氣孔有明顯變化，如圖３和表2。對四季海棠葉片背面氣孔的顯微觀察與照相顯示，對照植株葉片的氣孔成簇存在，每簇有氣孔２～５個，氣孔簇密度較大，不同株系氣孔直徑在１１．２５～２２．６５ μｍ。轉基因植株葉片的氣孔則獨立存在，氣孔密度較小，不同株系氣孔直徑在５．０３～２１．３８ μｍ，應與抗旱性能提高相關。

２．４ 滲透脅迫對四季海棠脯氨酸含量的影響

經過２０ ｈ不同濃度ＰＥＧ６０００的脅迫，脯氨酸在轉基因植株葉片中的積累有不同程度提高（圖４）。在２０％ ＰＥＧ６０００脅迫下，對照植株脯氨酸含量幾乎沒有變化，而轉基因植株增加了１倍。在４０％ ＰＥＧ６０００脅迫下，對照和轉基因植株脯氨酸含量都有了不同程度增加，其中轉基因植株的增長明顯超過對照，這表明轉基因植株抗脅迫能力較強。

２．５ 滲透脅迫下四季海棠ＳＯＤ活性的變化

從每組植株中各取２０片葉片，經過２０ h不同濃度PEG6000的脅迫處理后進行測定，結果如圖５。從圖5可以看出，在滲透脅迫下，所有植株體內ＳＯＤ活性都有不同程度增加。

２．６ 轉基因和非轉基因四季海棠耐旱性能的比較

選取同一時間獲得的大小較一致的組培苗，栽種于溫室內，停止澆水后連續觀察一段時間。結果表明，在停止澆水后第3周，兩種植株對干旱的忍受能力就表現出來：轉基因四季海棠的形態處在正常情況，而非轉基因植株已經出現萎蔫現象。當干旱時間延續到５０ d的時候，轉基因四季海棠開始出現萎蔫情況，而此時非轉基因植株已經枯黃；若此時開始補充水分，轉基因四季海棠又能重新恢復生長，而非轉基因植株已經完全干枯死亡。表明轉基因四季海棠至少能抵抗干旱５０ d，具有較強的抗旱能力。在試驗中還觀察到轉基因四季海棠即使在干旱情況下，葉片一直保持著較深的綠色，證實了細胞分裂素有延緩葉片衰老的作用。

３ 討論

３．１ ｉｐｔ基因對四季海棠植株形態的影響

本研究中觀察到轉基因四季海棠植株變矮、節間變短、葉綠素含量增加，花期也比非轉基因植株提前１~２周，這些性狀對于花卉植物而言是優良的園藝學特點。試驗中轉基因植株變化明顯，四季海棠屬于須根系，但轉基因植株的根系側根受到抑制，主根發達，這種根系的變化使根可以深入深層土壤吸收充足的水分，利于抵抗干旱。轉基因植株的葉片表面積有一定程度的減小，氣孔密度和直徑也有減小，這些都可以減少蒸騰，降低水分的流失，是轉基因四季海棠抗旱性能較強的原因之一。

轉基因四季海棠的側根受到抑制，但主根發達。側根的發育受多種內源因子和環境因子的調控，其中生長素的促進作用是其持續發育所必須的，而細胞分裂素因為充當了生長素的拮抗因子，所以導致側根生長受到抑制［８］。細胞分裂素對主根的影響具有負向調控作用，這個觀點得到學者們的廣泛接受。但也有相反觀點，于曉紅等［９］在研究轉ｉｐｔ棉花中發現轉基因棉花幼苗與對照植株相比普遍矮壯，但根系卻更為發達，初生根系生長受抑制，但次生根數目增多，且相對于對照植株增長明顯，這與本研究類似。關于其機理，Ｄｏｅｒｎｅｒ等［１０］認為可能與ＣＴＫs作用調控的靶標有關，當它的作用靶標為ｃｙｃＢｌ時，因該基因的過量表達會促進根延伸。

３．２ 轉基因四季海棠脯氨酸含量及ＳＯＤ酶活性檢測分析

通過對轉基因四季海棠相關生理指標的測定，發現其體內的脯氨酸含量增加了。脯氨酸是細胞進行滲透調節的重要物質，該物質不斷積累，可以降低細胞水勢，促進吸水或保持水分。本研究中發現，在正常情況下，轉基因植株和對照植株體內的脯氨酸含量相差不大，但是在高濃度 ＰＥＧ６０００的脅迫下，轉基因植株體內脯氨酸含量迅速升高，這反映了轉基因植株具有很強的抗旱性能。關于其機理，Ｓｉｌｖｅｉｒａ等［１１］提出了一個假說：谷氨酰胺合成酶在調節脯氨酸產生中起了主要作用。葉片中脯氨酸的積累是或者部分是由于干旱誘導的與蛋白質水解有關的谷氨酰胺合成酶活性的提高，導致谷氨酰胺前體在氨基酸庫中濃度提高。

轉基因植株在滲透脅迫下ＳＯＤ活性增強。ＳＯＤ可以有效清除因為逆境條件下產生的活性氧，以降低對植株的危害，從而提高植株的抗逆性，所以它也常常作為一種抗逆性的生理指標。本研究發現，在高滲透脅迫下，非轉基因和轉基因四季海棠體內的ＳＯＤ活性都提高了。

細胞分裂素能調節脯氨酸、ＳＯＤ活性的變化。將各組四季海棠植株的細胞分裂素含量與脯氨酸、ＳＯＤ活性的變化分別進行相關分析，可以看到它們之間的相關系數分別是０．９９和０．９５，說明細胞分裂素與這兩個指標的變化有明顯的相關性，更進一步說明，在高滲條件下細胞分裂素調節了脯氨酸的分泌和ＳＯＤ活性的變化。關于其機理有待進一步探討。

參考文獻：

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