基因槍法將Bhlea2基因?qū)胗衩椎某醪窖芯?/h1>
2012-01-01 00:00:00鄒璐琳魏建華張少斌王宏芝
湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年1期
摘要：構(gòu)建了牛耳草（Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ）胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因（Ｂｈｌｅａ２）的植物表達(dá)載體ｐＹＬ１，以玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）自交系５０１的愈傷組織為受體，利用基因槍法將Ｂｈｌｅａ２基因?qū)耄@得５１株抗性植株，經(jīng)ＰＣＲ檢測有１０株陽性植株，陽性率為１９．６％，初步證明外源基因已整合到玉米基因組中。
關(guān)鍵詞：玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ）；愈傷組織；Ｂｈｌｅａ２基因；基因槍法
中圖分類號：Ｓ５１３ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）01－0182-03
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｂｈｌｅａ２ Ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ Ｍａｉｚｅ ｂｙ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
ＺＯＵ Ｌｕ－ｌｉｎ１，２，ＷＥＩ Ｊｉａｎ－ｈｕａ２，ＺＨＡＮＧ Ｓｈａｏ－ｂｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｚｈｉ２
（１． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｇｒｏ－ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９７， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＹＬ１ ｏｆ Ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｔｈｅ Ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ） ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ ５０１ ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ． ５１ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ １０ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ １９．６％， ｉｔ ｗａｓ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ ｇｅｎｅ ｈａd ｂｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）； ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ； Ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ； ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）是全球最重要的糧、經(jīng)、飼三元作物，我國玉米的總產(chǎn)量僅次于水稻，占世界總產(chǎn)量的２０％左右，同時，我國也是玉米的第一消費(fèi)大國［１］。然而，由于氣候、地理以及玉米自身的水分生理狀況等原因，干旱已成為限制玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要非生物脅迫因素之一［２－８］。目前，通過轉(zhuǎn)基因手段培育耐旱品種，改良玉米干旱脅迫耐受性是最為有效的途徑之一［９，１０］。
胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（ＬＥＡ蛋白）是一類高度親水的小分子蛋白質(zhì)，在植物和動物中廣泛分布，大多與細(xì)胞脫水過程密切相關(guān)。很多ＬＥＡ蛋白在成熟的種子中積累，在種子萌發(fā)后迅速消失。Ｂｈｌｅａ２基因是復(fù)蘇植物苦苣苔科旋蒴苣苔屬植物牛耳草（Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ （Ｂｕｎｇｅ） Ｒ Ｂｒ．）中ＬＥＡ蛋白的編碼基因，在煙草中過量表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性［１１－１６］。目前，基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法較為完善［１７］，本研究利用基因槍法將耐旱基因Ｂｈｌｅａ２導(dǎo)入玉米的愈傷組織，為提高玉米耐旱性的研究奠定基礎(chǔ)。
１ 材料與方法
１．１ 材料與試劑
供試品種為玉米自交系５０１（京玉７號－５０１／京２４的親本之一），供試原始質(zhì)粒載體為ｐＢｉｎ１９－Ｂｈｌｅａ２、ｐｕｂｉ－ｂａｒ和ｐＢＰＣ２６，由北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心保存。
限制性內(nèi)切酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＩＰＴＧ、Ｘ－ｇａｌ等購自大連寶生物工程有限公司（Ｔａｋａｒａ）；高保真Ｔａｑ酶和ＫＯＤ酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；ｐＧＥＭＲ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、ＤＮＡ凝膠回收試劑盒、基因組ＤＮＡ提取試劑盒及ＤＮＡ電泳Ｍａｒｋｅｒ購自天根生化科技（北京）有限公司和北京全式金生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素購自北京奧賽博科技發(fā)展有限公司。
誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基：Ｎ６基本培養(yǎng)基＋１００ ｍｇ／Ｌ肌醇＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋１０ ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖＋４ ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ；篩選培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)基＋２ ｍｇ／Ｌ ｂａｒ；分化培養(yǎng)基：Ｎ６基本培養(yǎng)基＋１００ ｍｇ／Ｌ肌醇＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３＋１．５ ｍｇ／Ｌ ＫＴ＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖＋４ ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ＋１ ｍｇ／Ｌ ｂａｒ；生根、壯苗培養(yǎng)基：１／２ ＭS基本培養(yǎng)基＋１００ ｍｇ／Ｌ肌醇＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖＋４ ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ多效唑。
１．２ 方法
１．２．１ Ｂｈｌｅａ２基因表達(dá)載體的構(gòu)建 利用ＰＣＲ方法，以ｐＢｉｎ１９－Ｂｈｌｅａ２質(zhì)粒為模板克隆Ｂｈｌｅａ２基因。根據(jù)已知的Ｂｈｌｅａ２基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ序列號ＥＵ６６９１８４）設(shè)計引物：上游引物５’－ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣ
ＡＧＡＣＴＧＣＧＡＡＧＣ－３’，下游引物５’－ＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣ
Ｔ ＧＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴ－３’（劃線序列分別是ＢａｍＨⅠ和ＫｐｎⅠ酶切位點(diǎn)）。依ＫＯＤ擴(kuò)增系統(tǒng)說明書擴(kuò)增Ｂｈｌｅａ２基因，反應(yīng)條件為：９４ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，５３ ℃退火３０ ｓ，６８ ℃延伸３０ ｓ，３０個循環(huán)；６８ ℃延伸１０ ｍｉｎ。目的片段長度為４０２ ｂｐ，經(jīng)測序和酶切驗(yàn)證后，構(gòu)建表達(dá)載體ｐＹＬ１，如圖１所示，該表達(dá)載體目的基因Ｂｈｌｅａ２由Uｂｉｑｕｉｔｉｎ啟動子驅(qū)動，同時以Uｂｉｑｕｉｔｉｎ驅(qū)動的ｂａｒ基因作為選擇標(biāo)記基因。
１．２．２ 玉米基因槍轉(zhuǎn)化 取授粉后８～１４ ｄ的玉米果穗，剝?nèi)グ~，用７５％乙醇消毒５ ｍｉｎ，滅菌水沖洗３次后，挑出幼胚（１～２ ｍｍ），盾片朝上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，２５ ℃暗培養(yǎng)，直到誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，將胚性較好的愈傷組織直接接到繼代培養(yǎng)基上。制備微彈ＤＮＡ，調(diào)整ＤＮＡ濃度為１ ｇ／Ｌ，按ＢｉｏＲａｄ ＰＤＳ－１０００／／Ｈｅ型氣動式基因槍說明轟擊愈傷組織。將轟擊后的愈傷組織接于新的繼代培養(yǎng)基上恢復(fù)５ ｄ左右，轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基上暗處篩選培養(yǎng)，連續(xù)篩選３次，每次２～３周。然后選取抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，２６ ℃光照培養(yǎng)。待苗長到３～４ ｃｍ時，移至生根壯苗培養(yǎng)基中。
１．２．３ 再生植株的移栽 將無菌苗置于溫室中，向培養(yǎng)基中倒入少許自來水，煉苗３ ｄ，用自來水沖掉培養(yǎng)基，移入經(jīng)高溫滅菌的土壤（蛭石、田間土、草炭土、河沙的體積比為３∶１∶１∶１）中，待植株成活后移入田間。
１．２．４ 轉(zhuǎn)基因玉米植株的ＰＣＲ檢測 提取轉(zhuǎn)化植株的基因組ＤＮＡ，以非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，ｐＹＬ１質(zhì)粒為陽性對照，水為空白對照，用目的基因的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
２ 結(jié)果與分析
２．１ 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示ＰＣＲ擴(kuò)增的目的片段長度約為４００ ｂｐ（圖２）。將得到的片段回收后克隆到ｐＧＥＭＲ－Ｔ Ｅａｓｙ載體上，委托上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將該片段插入經(jīng)ＢａｍＨⅠ和ＫｐｎⅠ酶切后回收的ｐｕｂｉ－ｂａｒ載體，經(jīng)Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切回收ｕｂｉ－ｌｅａ－Ｎｏｓ，連入經(jīng)Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切后回收的ｐＢＰＣ２６載體中，獲得ｐＹＬ１載體，經(jīng)Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切驗(yàn)證正確（圖３）。
２．２ 轉(zhuǎn)基因玉米的獲得
用基因槍系統(tǒng)對優(yōu)良玉米自交系的胚性愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)篩選、分化后共獲得５１株抗性植株，經(jīng)分子檢測后轉(zhuǎn)入溫室中培養(yǎng)（圖４）。
２．３ 轉(zhuǎn)基因植株的ＰＣＲ檢測
提取轉(zhuǎn)化植株葉片的基因組ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增檢測（部分結(jié)果見圖５），其中１０株幼苗呈陽性反應(yīng)，陽性率達(dá)１９．６％，初步證明外源基因已整合到玉米基因組中。
３ 小結(jié)與討論
尋找高效的植物抗旱基因資源是目前提高農(nóng)作物抗旱性、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要舉措。生長在干旱環(huán)境中的復(fù)蘇植物具有耐極端干旱的特性，是寶貴的耐旱基因資源。與大多數(shù)植物采取吸水、保水、用水的策略不同，復(fù)蘇植物在干旱時會快速失水以達(dá)到一種類似休眠的狀態(tài)，在水分適宜時又迅速恢復(fù)生活狀態(tài)，繼續(xù)其生活史。很多研究發(fā)現(xiàn)ＬＥＡ蛋白編碼基因在種子成熟期特異表達(dá)，而已有的研究顯示復(fù)蘇植物牛耳草中的ＬＥＡ蛋白編碼基因Ｂｈｌｅａ２既在種子脫水成熟期表達(dá)，又在營養(yǎng)組織中參與脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并且已證明過量表達(dá)Ｂｈｌｅａ２基因可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性［１２，１３］。本研究通過基因槍法將該基因轉(zhuǎn)入玉米，以獲得耐旱性較好的轉(zhuǎn)基因玉米株系，目前通過ＰＣＲ檢測初步鑒定外源基因已整合到玉米基因組中，后期的表型鑒定工作還在進(jìn)行中。
參考文獻(xiàn)：
［１］ 楊東歌，楊鳳萍，陳緒清，等． 外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子ＣＢＦ４基因轉(zhuǎn)化玉米的獲得［Ｊ］． 作物學(xué)報，２００９，３５（１０）：１７５９－１７６３．
［２］ 胡瑞法，ＭＥＮＧ Ｅ Ｃ Ｈ，張世煌，等． 采用參與式方法評估中國玉米研究的優(yōu)先序［Ｊ］． 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００４，３７（６）：７８１－７８７．
［３］ 陳 梅． 以玉米幼胚為受體轉(zhuǎn)化海藻糖合成酶基因［Ｄ］． 成都： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，２００８．
［４］ 梁 濤，劉景利． 水分脅迫對玉米生長發(fā)育和產(chǎn)量的影響［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（３５）：１７４３６－１７４３７．
［５］ 張 梅，劉 煒，畢玉平． 植物中ＤＲＥＢｓ類轉(zhuǎn)錄因子及其在非生物脅迫中的應(yīng)用［Ｊ］， 遺傳，２００９，３１（３）：２３６－２４４．
［６］ ＮＥＵＭＡＮＮ Ｐ Ｍ． Ｃｏｐｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｄｒｏｕｇｈｔ－ｐｒｏｎｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ［Ｊ］． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ，２００８，１０１（７）：９０１－９０７．
［７］ ＴＯＬＤＩ Ｏ， ＴＵＢＡ Ｚ， ＳＣＯＴＴ Ｐ． Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ： Ｉｓ ｉｔ ａ ｇｏｌｄｍｉｎｅ ｆｏｒ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｒｏｐｓ？［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００９，１７６（２）：１８７－１９９．
［８］ ＭＯＯＲＥ Ｊ Ｐ， ＬＥ Ｎ Ｔ， ＢＲＡＮＤＴ Ｗ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｓｙｓｔｅｍｓ－ｂａｓｅｄ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１４（２）：１１０－１１７．
［９］ 李 楠． 抗旱基因ＨＶＡ１在煙草及玉米中遺傳轉(zhuǎn)化的研究［Ｄ］． 北京：首都師范大學(xué)，２００７．
［１０］ 孫傳波，曲文利，姜志磊，等． 農(nóng)桿菌介導(dǎo)向玉米莖尖導(dǎo)入ＨＡＬ１基因的初步研究［Ｊ］． 玉米科學(xué)，２００９，１７（６）：３２－３４．
［１１］ 吳仁花，王麗麗，王 智，等． 復(fù)蘇植物牛耳草引導(dǎo)蛋白基因的克隆與表達(dá)［Ｊ］． 自然科學(xué)進(jìn)展，２００８，１８（１０）：１１１１－１１１８．
［１２］ ＬＩＵ Ｘ，ＷＡＮＧ Ｚ，ＷＡＮＧ Ｌ，ｅｔ ａｌ． ＬＥＡ ４ ｇｒｏｕｐ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｎｔ Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ ｃｏｎｆｅｒ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１７６（１）：９０－９８．
［１３］ 劉 霞，鄧 馨．復(fù)蘇植物牛耳草Ｂｈｌｅａ２基因啟動子的分離和基因表達(dá)模式研究［Ｊ］． 自然科學(xué)進(jìn)展，２００９，１９（１）：３９－４４．
［１４］ ＪＩＡＮＧ Ｇ Ｑ， ＷＡＮＧ Ｚ， ＳＨＡＮＧ Ｈ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｅａｖｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｎｔ Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔａ，２００７， ２２５（６）：１４０５－１４２０．
［１５］ ＤＩＴＺＥＲ Ａ， ＢＡＲＴＥＬＳ Ｄ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ABA－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｕｌｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ４ ＬＥＡ ｇｅｎｅ ＣｐＣ２ ｆｒｏｍ Ｃ． ｐｌａｎｔａｇｉｎｅｕｍ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，６１（４）：６４３－６６３．
［１６］ ＷＡＮＧ Ｌ，ＳＨＡＮＧ Ｈ，ＬＩＵ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｇｌｙｃｉｎｅ-ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｎｔ Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００９，１１（６）：８３７－８４８．
［１７］ 張紅梅，賈利敏，王國英，等． 利用基因槍法將Ｂｔ基因?qū)胗衩變?yōu)良自交系［Ｊ］． 玉米科學(xué)，２００３，１１（１）：７－９．
摘要：構(gòu)建了牛耳草（Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ）胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因（Ｂｈｌｅａ２）的植物表達(dá)載體ｐＹＬ１，以玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）自交系５０１的愈傷組織為受體，利用基因槍法將Ｂｈｌｅａ２基因?qū)耄@得５１株抗性植株，經(jīng)ＰＣＲ檢測有１０株陽性植株，陽性率為１９．６％，初步證明外源基因已整合到玉米基因組中。
關(guān)鍵詞：玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ）；愈傷組織；Ｂｈｌｅａ２基因；基因槍法
中圖分類號：Ｓ５１３ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）01－0182-03
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｂｈｌｅａ２ Ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ Ｍａｉｚｅ ｂｙ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
ＺＯＵ Ｌｕ－ｌｉｎ１，２，ＷＥＩ Ｊｉａｎ－ｈｕａ２，ＺＨＡＮＧ Ｓｈａｏ－ｂｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｚｈｉ２
（１． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｇｒｏ－ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９７， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＹＬ１ ｏｆ Ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｔｈｅ Ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ） ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ ５０１ ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ． ５１ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ １０ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ １９．６％， ｉｔ ｗａｓ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ ｇｅｎｅ ｈａd ｂｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）； ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ； Ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ； ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ
玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）是全球最重要的糧、經(jīng)、飼三元作物，我國玉米的總產(chǎn)量僅次于水稻，占世界總產(chǎn)量的２０％左右，同時，我國也是玉米的第一消費(fèi)大國［１］。然而，由于氣候、地理以及玉米自身的水分生理狀況等原因，干旱已成為限制玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要非生物脅迫因素之一［２－８］。目前，通過轉(zhuǎn)基因手段培育耐旱品種，改良玉米干旱脅迫耐受性是最為有效的途徑之一［９，１０］。
胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（ＬＥＡ蛋白）是一類高度親水的小分子蛋白質(zhì)，在植物和動物中廣泛分布，大多與細(xì)胞脫水過程密切相關(guān)。很多ＬＥＡ蛋白在成熟的種子中積累，在種子萌發(fā)后迅速消失。Ｂｈｌｅａ２基因是復(fù)蘇植物苦苣苔科旋蒴苣苔屬植物牛耳草（Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ （Ｂｕｎｇｅ） Ｒ Ｂｒ．）中ＬＥＡ蛋白的編碼基因，在煙草中過量表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性［１１－１６］。目前，基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法較為完善［１７］，本研究利用基因槍法將耐旱基因Ｂｈｌｅａ２導(dǎo)入玉米的愈傷組織，為提高玉米耐旱性的研究奠定基礎(chǔ)。
１ 材料與方法
１．１ 材料與試劑
供試品種為玉米自交系５０１（京玉７號－５０１／京２４的親本之一），供試原始質(zhì)粒載體為ｐＢｉｎ１９－Ｂｈｌｅａ２、ｐｕｂｉ－ｂａｒ和ｐＢＰＣ２６，由北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心保存。
限制性內(nèi)切酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＩＰＴＧ、Ｘ－ｇａｌ等購自大連寶生物工程有限公司（Ｔａｋａｒａ）；高保真Ｔａｑ酶和ＫＯＤ酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；ｐＧＥＭＲ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、ＤＮＡ凝膠回收試劑盒、基因組ＤＮＡ提取試劑盒及ＤＮＡ電泳Ｍａｒｋｅｒ購自天根生化科技（北京）有限公司和北京全式金生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素購自北京奧賽博科技發(fā)展有限公司。
誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基：Ｎ６基本培養(yǎng)基＋１００ ｍｇ／Ｌ肌醇＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋１０ ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖＋４ ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ；篩選培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)基＋２ ｍｇ／Ｌ ｂａｒ；分化培養(yǎng)基：Ｎ６基本培養(yǎng)基＋１００ ｍｇ／Ｌ肌醇＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３＋１．５ ｍｇ／Ｌ ＫＴ＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖＋４ ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ＋１ ｍｇ／Ｌ ｂａｒ；生根、壯苗培養(yǎng)基：１／２ ＭS基本培養(yǎng)基＋１００ ｍｇ／Ｌ肌醇＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖＋４ ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋２ ｍｇ／Ｌ多效唑。
１．２ 方法
１．２．１ Ｂｈｌｅａ２基因表達(dá)載體的構(gòu)建 利用ＰＣＲ方法，以ｐＢｉｎ１９－Ｂｈｌｅａ２質(zhì)粒為模板克隆Ｂｈｌｅａ２基因。根據(jù)已知的Ｂｈｌｅａ２基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ序列號ＥＵ６６９１８４）設(shè)計引物：上游引物５’－ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣ
ＡＧＡＣＴＧＣＧＡＡＧＣ－３’，下游引物５’－ＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣ
Ｔ ＧＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴ－３’（劃線序列分別是ＢａｍＨⅠ和ＫｐｎⅠ酶切位點(diǎn)）。依ＫＯＤ擴(kuò)增系統(tǒng)說明書擴(kuò)增Ｂｈｌｅａ２基因，反應(yīng)條件為：９４ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，５３ ℃退火３０ ｓ，６８ ℃延伸３０ ｓ，３０個循環(huán)；６８ ℃延伸１０ ｍｉｎ。目的片段長度為４０２ ｂｐ，經(jīng)測序和酶切驗(yàn)證后，構(gòu)建表達(dá)載體ｐＹＬ１，如圖１所示，該表達(dá)載體目的基因Ｂｈｌｅａ２由Uｂｉｑｕｉｔｉｎ啟動子驅(qū)動，同時以Uｂｉｑｕｉｔｉｎ驅(qū)動的ｂａｒ基因作為選擇標(biāo)記基因。
１．２．２ 玉米基因槍轉(zhuǎn)化 取授粉后８～１４ ｄ的玉米果穗，剝?nèi)グ~，用７５％乙醇消毒５ ｍｉｎ，滅菌水沖洗３次后，挑出幼胚（１～２ ｍｍ），盾片朝上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，２５ ℃暗培養(yǎng)，直到誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，將胚性較好的愈傷組織直接接到繼代培養(yǎng)基上。制備微彈ＤＮＡ，調(diào)整ＤＮＡ濃度為１ ｇ／Ｌ，按ＢｉｏＲａｄ ＰＤＳ－１０００／／Ｈｅ型氣動式基因槍說明轟擊愈傷組織。將轟擊后的愈傷組織接于新的繼代培養(yǎng)基上恢復(fù)５ ｄ左右，轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基上暗處篩選培養(yǎng)，連續(xù)篩選３次，每次２～３周。然后選取抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，２６ ℃光照培養(yǎng)。待苗長到３～４ ｃｍ時，移至生根壯苗培養(yǎng)基中。
１．２．３ 再生植株的移栽 將無菌苗置于溫室中，向培養(yǎng)基中倒入少許自來水，煉苗３ ｄ，用自來水沖掉培養(yǎng)基，移入經(jīng)高溫滅菌的土壤（蛭石、田間土、草炭土、河沙的體積比為３∶１∶１∶１）中，待植株成活后移入田間。
１．２．４ 轉(zhuǎn)基因玉米植株的ＰＣＲ檢測 提取轉(zhuǎn)化植株的基因組ＤＮＡ，以非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，ｐＹＬ１質(zhì)粒為陽性對照，水為空白對照，用目的基因的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
２ 結(jié)果與分析
２．１ 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示ＰＣＲ擴(kuò)增的目的片段長度約為４００ ｂｐ（圖２）。將得到的片段回收后克隆到ｐＧＥＭＲ－Ｔ Ｅａｓｙ載體上，委托上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將該片段插入經(jīng)ＢａｍＨⅠ和ＫｐｎⅠ酶切后回收的ｐｕｂｉ－ｂａｒ載體，經(jīng)Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切回收ｕｂｉ－ｌｅａ－Ｎｏｓ，連入經(jīng)Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切后回收的ｐＢＰＣ２６載體中，獲得ｐＹＬ１載體，經(jīng)Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切驗(yàn)證正確（圖３）。
２．２ 轉(zhuǎn)基因玉米的獲得
用基因槍系統(tǒng)對優(yōu)良玉米自交系的胚性愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)篩選、分化后共獲得５１株抗性植株，經(jīng)分子檢測后轉(zhuǎn)入溫室中培養(yǎng)（圖４）。
２．３ 轉(zhuǎn)基因植株的ＰＣＲ檢測
提取轉(zhuǎn)化植株葉片的基因組ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增檢測（部分結(jié)果見圖５），其中１０株幼苗呈陽性反應(yīng)，陽性率達(dá)１９．６％，初步證明外源基因已整合到玉米基因組中。
３ 小結(jié)與討論
尋找高效的植物抗旱基因資源是目前提高農(nóng)作物抗旱性、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要舉措。生長在干旱環(huán)境中的復(fù)蘇植物具有耐極端干旱的特性，是寶貴的耐旱基因資源。與大多數(shù)植物采取吸水、保水、用水的策略不同，復(fù)蘇植物在干旱時會快速失水以達(dá)到一種類似休眠的狀態(tài)，在水分適宜時又迅速恢復(fù)生活狀態(tài)，繼續(xù)其生活史。很多研究發(fā)現(xiàn)ＬＥＡ蛋白編碼基因在種子成熟期特異表達(dá)，而已有的研究顯示復(fù)蘇植物牛耳草中的ＬＥＡ蛋白編碼基因Ｂｈｌｅａ２既在種子脫水成熟期表達(dá)，又在營養(yǎng)組織中參與脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并且已證明過量表達(dá)Ｂｈｌｅａ２基因可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性［１２，１３］。本研究通過基因槍法將該基因轉(zhuǎn)入玉米，以獲得耐旱性較好的轉(zhuǎn)基因玉米株系，目前通過ＰＣＲ檢測初步鑒定外源基因已整合到玉米基因組中，后期的表型鑒定工作還在進(jìn)行中。
參考文獻(xiàn)：
［１］ 楊東歌，楊鳳萍，陳緒清，等． 外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子ＣＢＦ４基因轉(zhuǎn)化玉米的獲得［Ｊ］． 作物學(xué)報，２００９，３５（１０）：１７５９－１７６３．
［２］ 胡瑞法，ＭＥＮＧ Ｅ Ｃ Ｈ，張世煌，等． 采用參與式方法評估中國玉米研究的優(yōu)先序［Ｊ］． 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００４，３７（６）：７８１－７８７．
［３］ 陳 梅． 以玉米幼胚為受體轉(zhuǎn)化海藻糖合成酶基因［Ｄ］． 成都： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，２００８．
［４］ 梁 濤，劉景利． 水分脅迫對玉米生長發(fā)育和產(chǎn)量的影響［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（３５）：１７４３６－１７４３７．
［５］ 張 梅，劉 煒，畢玉平． 植物中ＤＲＥＢｓ類轉(zhuǎn)錄因子及其在非生物脅迫中的應(yīng)用［Ｊ］， 遺傳，２００９，３１（３）：２３６－２４４．
［６］ ＮＥＵＭＡＮＮ Ｐ Ｍ． Ｃｏｐｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｄｒｏｕｇｈｔ－ｐｒｏｎｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ［Ｊ］． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ，２００８，１０１（７）：９０１－９０７．
［７］ ＴＯＬＤＩ Ｏ， ＴＵＢＡ Ｚ， ＳＣＯＴＴ Ｐ． Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ： Ｉｓ ｉｔ ａ ｇｏｌｄｍｉｎｅ ｆｏｒ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｒｏｐｓ？［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００９，１７６（２）：１８７－１９９．
［８］ ＭＯＯＲＥ Ｊ Ｐ， ＬＥ Ｎ Ｔ， ＢＲＡＮＤＴ Ｗ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｓｙｓｔｅｍｓ－ｂａｓｅｄ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１４（２）：１１０－１１７．
［９］ 李 楠． 抗旱基因ＨＶＡ１在煙草及玉米中遺傳轉(zhuǎn)化的研究［Ｄ］． 北京：首都師范大學(xué)，２００７．
［１０］ 孫傳波，曲文利，姜志磊，等． 農(nóng)桿菌介導(dǎo)向玉米莖尖導(dǎo)入ＨＡＬ１基因的初步研究［Ｊ］． 玉米科學(xué)，２００９，１７（６）：３２－３４．
［１１］ 吳仁花，王麗麗，王 智，等． 復(fù)蘇植物牛耳草引導(dǎo)蛋白基因的克隆與表達(dá)［Ｊ］． 自然科學(xué)進(jìn)展，２００８，１８（１０）：１１１１－１１１８．
［１２］ ＬＩＵ Ｘ，ＷＡＮＧ Ｚ，ＷＡＮＧ Ｌ，ｅｔ ａｌ． ＬＥＡ ４ ｇｒｏｕｐ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｎｔ Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ ｃｏｎｆｅｒ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１７６（１）：９０－９８．
［１３］ 劉 霞，鄧 馨．復(fù)蘇植物牛耳草Ｂｈｌｅａ２基因啟動子的分離和基因表達(dá)模式研究［Ｊ］． 自然科學(xué)進(jìn)展，２００９，１９（１）：３９－４４．
［１４］ ＪＩＡＮＧ Ｇ Ｑ， ＷＡＮＧ Ｚ， ＳＨＡＮＧ Ｈ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｅａｖｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｎｔ Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔａ，２００７， ２２５（６）：１４０５－１４２０．
［１５］ ＤＩＴＺＥＲ Ａ， ＢＡＲＴＥＬＳ Ｄ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ABA－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｕｌｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ４ ＬＥＡ ｇｅｎｅ ＣｐＣ２ ｆｒｏｍ Ｃ． ｐｌａｎｔａｇｉｎｅｕｍ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，６１（４）：６４３－６６３．
［１６］ ＷＡＮＧ Ｌ，ＳＨＡＮＧ Ｈ，ＬＩＵ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｇｌｙｃｉｎｅ-ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｎｔ Ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００９，１１（６）：８３７－８４８．
［１７］ 張紅梅，賈利敏，王國英，等． 利用基因槍法將Ｂｔ基因?qū)胗衩變?yōu)良自交系［Ｊ］． 玉米科學(xué)，２００３，１１（１）：７－９．
