實時熒光定量PCR技術在植物檢疫中應用的研究進展

摘要：實時熒光定量ＰＣＲ技術是在ＰＣＲ反應體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監測整個ＰＣＲ反應進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，具有操作簡便、快速高效、高通量、高敏感性等特點。近年來，實時熒光定量ＰＣＲ技術在植物檢疫研究上不斷深入，大大提高了植物疫情的檢測效率和監測防治水平。綜合論述了實時熒光定量ＰＣＲ技術在由真菌、細菌、病毒和線蟲引發的植物疫情的檢測與應用。

關鍵詞：實時熒光定量ＰＣＲ技術；植物檢疫；植物病害

中圖分類號：Ｓ４１－３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）01－0005-04

Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Fluorescent Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ

ＨＵＡＮＧ Ｈａｉ－ｑｕａｎ

（Ｂｅｉｌｕｎ Ｅｎｔｒｙ－Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｎｉｎｇｂｏ ３１５８００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＦＱ－ＰＣＲ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ ｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ， ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＰＣＲ） ｐｒｏｃｅｓｓ could be monitored ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ quantitatively ａｎａｌｙｚｅ ｕｎｋｎｏｗｎ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｍａｋｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ． ＦＱ－ＰＣＲ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ， ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ， ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｔｃ． Ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ， application of ＦＱ－ＰＣＲ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ was studied ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ detecting ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｐｉｄｅｍｉｃ． Tｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｆｕｎｇｉ， ｂａｃｔｅｒｉａ， ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ was comprehensively described．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ； ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ； ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ

實時熒光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ＦＱ－ＰＣＲ）技術是２０世紀９０年代中期發展起來的一種新型核酸定量技術。最早是由Ｈｉｇｕｃｈｉ等［１］于１９９２年提出來的，１９９６年由美國Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司推出。與普通ＰＣＲ相比，它具有快速、靈敏、高通量、特異性強、自動化程度高、重復性好、定量準確等特點。過去實時熒光定量ＰＣＲ技術主要應用在醫學診斷、新型農業、基礎研究等領域［２］，而在植物檢疫中的應用相對較少［３］，隨著分子生物學的不斷發展，特別是在檢疫檢驗系統，實時熒光定量ＰＣＲ技術已經被廣泛用來檢測植物病害，有效地遏制了國外有害生物的入侵，保證了生物入境安全。

１ 實時熒光定量ＰＣＲ技術原理

實時熒光定量ＰＣＲ技術是指在ＰＣＲ反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個ＰＣＲ技術進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量ＰＣＲ技術中有一個很重要的概念，即Ｃｔ值。Ｃ代表循環（Ｃｙｃｌｅ），ｔ代表閾值（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）。Ｃｔ值是指每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ｃｔ值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ｃｔ值越小。因此，要利用已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線，再利用分析軟件獲得未知樣品的Ｃｔ值，便能根據標準曲線計算出該樣品的起始拷貝數［４］。

２ 實時熒光定量ＰＣＲ技術檢測方法

該檢測方法主要分為兩大類：第一類是使用特異的雙鏈ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合染料，常用的有ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ和ＬＣ Ｇｒｅｅｎ；第二類則是應用熒光標記探針，如ＴａｑＭａｎ探針、分子信標等，是建立在熒光共振能量轉移原理（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）［５］上的。

２．１ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ熒光染料檢測技術

ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ是一種非飽和菁類熒光素，可以嵌合于ＤＮＡ雙鏈結構的小溝中，非特異地與ｄｓＤＮＡ分子結合，是應用最廣泛的非探針類化學檢測物。當它與 ＤＮＡ雙鏈結合時發出熒光，熒光強度隨著聚合反應的進行逐漸增加，便可被熒光探測系統檢測到。但是由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性?？梢栽冢校茫医Y束時通過分析擴增產物的熔解曲線來排除非特異性擴增［２］。

２．２ Ｔａｑ Ｍａｎ探針檢測方法

ＴａｑＭａｎ水解探針主要是利用Ｔａｑ酶５’→３’外切核酸酶活性，并在ＰＣＲ反應體系中加入一個熒光標記探針［２］。探針的５’端熒光發射基團ＦＡＭ（６－羧基熒光素），３’端標記淬滅基團ＴＡＭＲＡ（６－羧基四甲基丹諾明）。該探針在ＰＣＲ過程中不能延伸。當探針保持完整時，根據ＦＲＥＴ原理，３’端淬滅基團抑制５’端發射基團的熒光發射；在ＰＣＲ的退火期，引物和探針同時與ＤＮＡ模板發生特異性雜交；延伸期，引物在Ｔａｑ酶作用下沿ＤＮＡ模板延伸，當到達探針處，Ｔａｑ酶發揮５’→３’外切核酸酶活性，將探針切斷。此時發射基團遠離淬滅基團，熒光信號得以釋放，熒光探測系統便會檢測到熒光密度有所增加。模板每復制１次，就有１個探針被切斷并伴有１個熒光信號的釋放。產物與熒光信號產生一對一的對應關系，隨著產物的增加，熒光信號不斷增強。當信號增強到某一閾值，此時的循環次數即為循環閾值（Ｃｔ）。Ｃｔ與ＰＣＲ體系中起始模板數的對數之間有嚴格的線性關系，利用不同標準模板擴增的Ｃｔ值和標準模板數經過對數擬合作圖，制成標準曲線，再根據待測樣品的Ｃｔ值可以準確地確定起始模板的數量［６］。

２．３ 實時熒光定量ＰＣＲ技術定量方法

在實時熒光定量ＰＣＲ中，模板的定量有兩種方法，即絕對定量和相對定量。絕對定量指用已知的標準曲線來推算未知的樣本量；相對定量指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化［７］。

３ 實時熒光定量ＰＣＲ技術在植物檢疫研究中的應用

３．１ 在真菌引起的植物病害檢測中的應用

１９９９年Ｂｏｈｍ等［８］首次將實時熒光定量ＰＣＲ方法應用于植物病理學研究，２０００年有學者首次將該方法應用于植物病理真菌的檢測［９］。在我國，使用定量ＰＣＲ技術對植物病理真菌檢測相對較晚，程穎慧等［１０］報道了小麥印度腥黑穗病菌的實時熒光定量ＰＣＲ檢測。章桂明等［１１］報道應用ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ探針檢測小麥印度腥黑穗病菌和黑麥草腥黑穗病菌，分別建立了小麥印度腥黑穗病菌和黑麥草腥黑穗病菌實時熒光單重ＰＣＲ和實時熒光雙重ＰＣＲ檢測方法。Ｍｉｇｕｅｌ等［１２］使用實時熒光定量ＰＣＲ技術檢測了罌粟攜帶霜霉菌引起的霜霉病。年四季等［１３］根據篩選的ＴＣＫ獨有差異基因片段（１ ３２２ ｂｐ）設計特異性引物對ＣＱＵＴＣＫ４／ＣＱＵＴＣＫ５和ＴａｑＭａｎ 探針ＣＱＵＰ１，建立ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ熒光染料法和ＴａｑＭａｎ水解探針法定量ＰＣＲ檢測體系，均可成功鑒別出ＴＣＫ與小麥矮腥黑穗病菌，并可快速準確檢測小麥矮腥黑穗病菌冬孢子和檢測罹病小麥植株體內的侵染菌絲體。黃國明等［１４］設計了通用ＴａｑＭａｎ探針及引物和特異ＴａｑＭａｎ探針及共用引物，結合通用探針的單色熒光ＰＣＲ和特異探針的雙色熒光ＰＣＲ兩種方法，成功摸索出一種Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｃｏｅｎｏｐｈｉａｌｕｍ和Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ ｌｏｌｉｉ的菌絲及單粒種子快速、穩定、可靠、特異性強的熒光ＰＣＲ檢測方法，使檢測時間由至少１個月縮短至７～８ ｈ，而且檢測靈敏度達到單粒種子。蘇丹等［１５］成功建立了利用ＰＣＲ技術對黑麥草中內生真菌感染狀況的檢測和定量分析方法，發現不同植株之間內生真菌含量差異較大。

３．２ 在細菌引起的植物病害檢測中的應用

植物病原細菌（Pｈｙｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）主要類群有１６個屬，除土壤桿菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、歐文氏菌屬（Ｅｒｗｉｎｉａ）、假單胞菌屬（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、黃單胞菌屬（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）和鏈絲菌屬（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）之外，革蘭氏陰性菌增加了嗜酸菌屬（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、根桿菌屬（Ｒｈｉｚｏｂｚｃｔｅｒ）、根單胞菌屬（Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ）、嗜木質菌屬（Ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、泛生菌屬（Ｐａｎｔｏｅａ）和木質部小菌屬（Xｙｌｅｌｌａ）等；革蘭氏陽性細菌則有棒形桿菌屬（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、節桿菌屬（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、短小桿菌屬（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒ）、紅球菌屬（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｘｃｕｓ）、芽孢桿菌屬（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、布克氏菌屬和韌皮部桿菌屬等能引起多種農作物、園林觀賞、 經濟作物及牧草上的病害。利用熒光定量ＰＣＲ技術準確成功鑒定的有柑橘黃龍病菌［１６，１７］、番茄潰瘍病菌（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｍｉｃｈｉｇａｎｅｒｓｉｓ）［１８］、柑橘潰瘍病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）［１９］、西瓜細菌性果斑病菌（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ． ｃｉｔｒｕｌｌｉ）［２０］、 梨火疫病菌（Ｅｒｗｉｎｉａａｍｙｌｏｖｏｒａ）［２1］、 水稻白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ）［２２，２３］、玉米細菌性枯萎病菌（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉｓｕｂ ｓｐ． Ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）［２4］、 苜蓿細菌性萎蔫病菌（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍｓ）［２5］、菜豆細菌 性 萎 蔫 病 菌（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ｐｖ．Ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ）［２6］、哈密瓜細菌性果斑病菌（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ． Ｃｉｔｒｕｌｌｉ）［２7］、香蕉枯萎細菌性病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｒａｃｅ ２）［２8］、馬鈴薯環腐病菌（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ）［２9］等細菌的檢測。植物病原細菌的傳統檢測方法主要是采用生物學和免疫學的方法，這種方法費時費力，而且準確率也不高。但實時熒光定量ＰＣＲ技術可以很好地解決這些問題，不僅有效地提高了檢測速度和水平，而且靈敏度也比一般的檢測方法高出１００倍左右。還有一個明顯的優點是試驗中不需要ＰＣＲ的后續處理及病原菌的分離培養，大大簡化了試驗操作步驟，縮短了檢測時間。

３．３ 在病毒引起的植物病害檢測中的應用

植物病毒是僅次于真菌的一類病原體，由于病毒對寄主的絕對寄生性，使其危害增大，同時防治又很困難，故病毒病有植物癌癥之稱。植物病毒的檢測方法主要有生物學方法、免疫學方法和分子生物學方法［３０］，其中檢測最方便的莫過于實時熒光定量ＰＣＲ技術，它具有靈敏、快速和特異性強等優點。煙草環斑病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ．）為中國公布的第二類禁止進境檢疫有害生物，鄭耘等［３１］首次應用直接結合反轉錄實時熒光ＰＣＲ技術檢測煙草環斑病毒。楊偉東等［３２］首次應用免疫捕捉反轉錄實時熒光ＰＣＲ技術成功檢測煙草環斑病毒，由此解決了煙草環斑病毒檢測工作中由于隱癥、干擾物質存在而影響檢測結果的問題，為植物病毒病原的快速、簡便有效檢測提供了一套科學的方法。聞偉剛等［３３］用實時熒光ＰＣＲ技術檢測了齒蘭環斑病毒與建蘭花葉病毒，用這種方法從來自臺灣的蝴蝶蘭樣品中檢出齒蘭環斑病毒。聞偉剛等［３４］建立了玉米褪綠斑駁病毒的熒光定量ＰＣＲ的檢測方法，其靈敏度比普通ＲＴ－ＰＣＲ高出１００倍。

３．４ 在線蟲引起的植物病害檢測中的應用

松材線蟲病是世界上四大林木病害之一，也是世界重要的檢疫性有害生物。在我國松褐天牛是它的主要傳媒昆蟲。松材線蟲病致病力強，寄主死亡速度快，傳播也快，且常常猝不及防，一旦發生，則治理難度大。由于環境、氣候和不同寄主的影響，在形態上存在一定的差異［３５］?，F在發現除了從美國、日本等疫區檢測出木質包裝攜帶松材線蟲外，一些非疫區國家也檢測出松材線蟲，口岸檢疫工作形勢嚴峻。實時熒光ＰＣＲ技術在口岸植物檢疫工作中起到了很大的作用。王金成等［３６］用探針法對松材線蟲進行了定量ＰＣＲ檢測，為口岸快速準確地鑒別松材線蟲建立了行業標準。王翀等［３７］建立了鱗球莖莖線蟲實時熒光ＰＣＲ的檢測技術，整個檢測過程只需要３０～１２０ｍｉｎ，能夠滿足口岸檢驗檢疫快速通關的要求。有學者應用ＴａｑＭａｎ探針進行馬鈴薯金線蟲和白線蟲實時熒光ＰＣＲ的研究，可高度靈敏地檢測單個馬鈴薯金線蟲的孢囊或幼蟲，最高檢測靈敏度達到１０ｆｇ［３８，３９］。龔艷清等［４０］建立了簡單異尖線蟲ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ熒光定量ＰＣＲ技術方法，可用于簡單異尖線蟲的鑒定。

４ 結語

目前實時熒光定量ＰＣＲ技術作為核酸定量的方法已經廣泛地應用于植物研究，例如植物抗逆性研究，轉基因植物檢測，植物抗病性研究，植物發育學研究，環境對植物基因表達的影響［４１］。可見其應用的領域遠比本研究涉及的范圍要廣得多。但是實時熒光ＰＣＲ技術也有其局限性，會受到非靶序列ＤＮＡ的干擾，如何排除背景的影響，使實時熒光定量ＰＣＲ具有普遍性是人們面臨的又一個挑戰。

植物病害危害性是極其嚴重的，防治十分困難，例如柑橘潰瘍病、柑橘黃龍病、果樹根癌病、水稻細菌性條斑病和水稻白葉枯病等都是許多國家的植物檢疫性病害，防治或根除辦法都是極其棘手和困難的。口岸在加強植物檢疫工作的同時，也要不斷地進行基礎研究，建立起一系列生物安全措施和簡便準確的檢測方法，以便進一步提高口岸植物檢疫工作的效率。

總之，實時熒光定量ＰＣＲ技術為植物檢疫工作的開展提供了強有力的技術支撐，如果能與其他分子生物學以及傳統方法相結合，將會推動口岸檢疫工作更好地發展。

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