利用ACGM標記發掘杉科功能基因

摘要：利用４對日本柳杉（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）的擴增共有序列遺傳標記（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒ，ＡＣＧＭ）引物，在杉科７個屬的１１份材料中擴增出了２５個ＰＣＲ產物，測序、ＢＬＡＳＴ比對和聯配結果表明，４對引物的擴增產物分別與擬南芥和日本柳杉的４個基因（ＭＹＢ基因、ＣＣＣＨ－型鋅指蛋白基因、查爾酮合成酶基因、抗凍相關基因ＣＯＲ４７）具有較高的相似度性，推測這些ＰＣＲ產物為這４個基因在杉科物種中的同源基因片段。研究結果表明ＡＣＧＭ標記可被用于發掘其他物種的功能基因片段。

關鍵詞：ＡＣＧＭ；杉科；功能基因；同源基因

中圖分類號：Ｑ９４９．６６＋６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）01－0177-05

Ｕｓｉｎｇ ＡＣＧＭ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Exploring Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｔａｘｏｄｉａｃｅａｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ

ＪＩＡ Ｑｉｎｇ，ＴＯＮＧ Ｚａｉ－ｋａｎｇ，ＬＵ Ｙｏｎｇ－ｑｕａｎ

（Ｎｕｒｔｕｒｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉｎ＇ａｎ ３１１３００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ４ aｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ （ＡＣＧＭ） ｏｆ Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｉｔ ｎｏｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． ２５ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ １１ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ Ｔａｘｏｄｉａｃｅａｅ ｆａｍｉｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ＭＹＢ ｇｅｎｅ， ＣＣＣＨ－ｔｙｐｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ， ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｏｌｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｎｄ Ｃ． ｊａｐｏｎｉｃａ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｔｈｕｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅ． Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＡＣＧＭ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＡＣＧＭ； Ｔａｘｏｄｉａｃｅａｅ； ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ； ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｇｅｎｅ

擴增共有序列遺傳標記（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ，ＡＣＧＭ）是基于表達序列的保守性開發的分子標記［１］，該標記的引物在表達序列的保守區內，引物本身就是表達序列的一部分，因此ＡＣＧＭ引物的ＰＣＲ擴增產物是表達基因序列的片段。利用ＡＣＧＭ標記不僅可以探明所研究物種之間的多態性信息，而且可以獲得大量目的基因的同源片段。本研究利用日本柳杉（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）ＭＹＢ（Mｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ）基因［２］、 ＣＣＣＨ－型鋅指蛋白（ＣＣＣＨ－ｔｙｐｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）基因［３］、查爾酮合成酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）基因［４］和抗凍相關（ｃｏｌｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）基因ＣＯＲ４７［５］的ＡＣＧＭ引物，在１１份杉科材料中進行ＰＣＲ擴增，對ＰＣＲ產物測序和比對，以探討利用ＡＣＧＭ標記快速獲得目的基因片段的可行性。

１ 材料與方法

１．１ 引物序列及推測功能

４對日本柳杉ＡＣＧＭ引物序列及所在基因的功能見表１。

１．２ 植物材料

杉科７個屬的１１份植物材料（表２）于２０１０年１０月采自杭州植物園裸子植物園區，用冰盒保存帶回實驗室，采用ＣＴＡＢ法提取植物葉片的ＤＮＡ［６］。

１．３ ＰＣＲ擴增

ＰＣＲ反應體系為：ＤＮＡ（２５ ｎｇ／μＬ） ２ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ Ｕ／μＬ， Ｔａkａrａ） ０．２ μＬ，正反向引物（１０ μｍｏｌ／μＬ）各１ μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ， Ｔａkａrａ）１．６ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ到２０ μＬ。反應條件為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，５５～５８ ℃退火３０ ｓ（根據引物調節退火溫度），７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０個循環；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。取擴增產物２ μＬ加１ μＬ上樣緩沖液，６％聚丙烯酰胺凝膠電泳（８０ Ｖ、３．５ ｈ），參考許紹斌等［７］的方法銀染顯色。

１．４ 擴增產物的檢測

上述ＰＣＲ產物聚丙烯酰胺凝膠顯色后，切割目的條帶并參照李衛東等［８］的方法回收，?。?μＬ回收產物做第二輪ＰＣＲ擴增，體系和條件與第一輪相同。取第二輪ＰＣＲ產物２ μＬ，于１％瓊脂糖凝膠電泳，確定產物單一明亮后，由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

２ 結果與分析

４對ＡＣＧＭ引物在１１份杉科植物材料中的擴增產物測序結果見表２，將這些產物與擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）以及日本柳杉相應基因的序列進行ＢＬＡＳＴ同源性比對，并用ＣｌｕｓｔａｌＸ軟件進行多序列聯配，用ＧｅｎｅＤｏｃ軟件顯示多序列聯配的結果。

２．１ Ｇ１的ＰＣＲ產物分析

Ｇ１引物在１１份材料的８份中獲得了目標條帶（圖１）。測序結果表明，這些片段的長度為２４７～２６５ ｂｐ，與擬南芥ＭＹＢ基因中的相應序列（ＡＭＹＢ）ＢＬＡＳＴ比對的結果顯示這些序列與ＡＭＹＢ的序列相似度為７３％～７５％，推測這些ＰＣＲ產物為ＡＭＹＢ在杉科物種中的同源基因片段。

應用ＣｌｕｓｔａｌＸ軟件對實驗獲得的８個測序結果與已經公布的日本柳杉及擬南芥ＭＹＢ基因相應序列進行聯配（圖２）。聯配結果表明，實驗所獲序列與日本柳杉ＭＹＢ基因（ＣＭＹＢ）的相似度為８３％～９５％，說明擴增得到的序列為杉科各材料中的ＭＹＢ基因片段。

２．２ Ｇ２的ＰＣＲ產物分析

Ｇ２引物在１１份材料中均有明顯的擴增產物并且均成功回收（圖３）。測序結果表明這些片段長度在２５１～２６５ ｂｐ之間。與擬南芥ＣＣＣＨ－型鋅指蛋白基因（ＡＣＣＣ－Ｈ）中的相應序列ＢＬＡＳＴ比對的結果顯示這些片段與ＡＣＣＣ－Ｈ序列相似度為７８％～８０％，推測這些ＰＣＲ產物為ＡＣＣＣ－Ｈ在杉科物種中的同源基因片段。

應用ＣｌｕｓｔａｌＸ軟件對實驗獲得的１１個測序結果與已經公布的日本柳杉及擬南芥ＣＣＣＨ－型鋅指蛋白基因序列進行聯配（圖４）。聯配結果表明，實驗所獲序列與日本柳杉ＣＣＣＨ－型鋅指蛋白基因（ＣＣＣＣ－Ｈ）的相似度為９３％～９７％。說明擴增得到的序列為杉科各材料中的ＣＣＣＨ－型鋅指蛋白基因片段。

２．３ Ｇ３的ＰＣＲ產物分析

Ｇ３引物只在１１份材料中的５、６、７號３份材料中有較為明顯的擴增產物（圖5）。測序結果表明３份材料擴增出的片段長度分別為柳杉２５０ ｂｐ、短茸柳杉２５５ ｂｐ和日本柳杉２５５ ｂｐ。ＢＬＡＳＴ比對的結果顯示這３個序列與擬南芥查爾酮合成酶基因（ＡＣＨＳ）的序列相似度均為６９％，推測這些ＰＣＲ產物為ＡＣＨＳ在杉科物種中的同源片段。

應用ＣｌｕｓｔａｌＸ軟件對實驗獲得的３個測序結果與已經公布的日本柳杉及擬南芥查爾酮合成酶基因序列進行聯配（圖６）。聯配結果表明，實驗所獲序列與日本柳杉查爾酮合成酶基因（ＣＣＨＳ）序列相似度為５７％～５８％，說明擴增得到的序列可能為ＣＣＨＳ的同源基因片段。

２．４ Ｇ４的ＰＣＲ產物分析

Ｇ４只在１１份材料中的５、６、７號３份材料中有較為明顯的擴增產物（圖7）。測序結果表明３份材料擴增出的片段長度分別為柳杉２３０ ｂｐ、短茸柳杉２２９ ｂｐ和日本柳杉２２９ ｂｐ。ＢＬＡＳＴ比對的結果顯示這３個片段與擬南芥抗凍相關基因ＣＯＲ４７（ＡＣＯＲ）中相應序列的相似度為７４％～７５％，推測這些ＰＣＲ產物是ＡＣＯＲ在杉科物種中的同源基因片段。

應用ＣｌｕｓｔａｌＸ軟件對實驗獲得的３個測序結果與已經公布的日本柳杉及擬南芥相應抗凍相關基因ＣＯＲ４７序列進行聯配，結果如圖８所示。聯配結果表明，實驗所獲序列與日本柳杉及擬南芥相應抗凍相關基因ＣＯＲ４７（ＣＣＯＲ）的相似度為５１％～５２％。說明擴增得到的序列可能為ＣＣＯＲ的同源基因。

３ 討論

利用ＡＣＧＭ標記克隆基因從原理上說屬于同源克隆，所以也依賴于同源序列。隨著各種生物尤其是模式生物的序列信息越來越多，這種克隆方法的限制性也越來越小。而且由于ＡＣＧＭ標記利用的是較為保守的編碼區序列，所以在科屬內的通用性很高，有些甚至可以在其他科屬的植物中互用。例如賀欣等［9］從盧泳全等［10］開發的３７對禾本科（Ｐｏａｃｅａｅ）ＡＣＧＭ引物中篩選出了１８對能在蝶形花科（Ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅａｅ）山螞蝗屬（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）植物中有效擴增的ＡＣＧＭ引物。表明利用ＡＣＧＭ標記可以有效地在不同物種中快速、批量克隆功能基因片段，在此基礎上結合ＲＡＣＥ等技術，可以快速獲得目的基因全長。

由于受生長周期的限制，很多木本植物的遺傳基礎研究很薄弱，從而限制了分子生物學研究的進一步開展，造成基因克隆等很多分子生物學技術不能在木本植物中有效地應用。本研究所利用的ＡＣＧＭ標記是利用保守序列設計引物，它在作為標記的同時，也是一種通用性較高的同源序列引物。因此該標記在對目標物種之間的多態性分析的同時，還提供了這些物種的同源序列信息，為缺少生物信息植物的基因克隆提供了一條捷徑。

參考文獻：

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