一株沼澤紅假單胞菌對氮磷的同化能力

摘要：采用單因素和正交試驗(yàn)研究了不同營養(yǎng)成分對一株沼澤紅假單胞菌氮磷同化能力的影響。結(jié)果表明，ＫＨ２ＰＯ４對沼澤紅假單胞菌同化氮磷的能力有顯著的影響。在同等發(fā)酵生物量的情況下，當(dāng)ＮＨ４Ｃｌ為０．０５ ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４為１．４０ ｇ／Ｌ、酵母抽提物為１．００ ｇ／Ｌ時(shí)，可使沼澤紅假單胞菌的氮磷同化率分別由原來的32.51％和５．９８％提高到48.02％和７．76％。

關(guān)鍵詞：沼澤紅假單胞菌；濃度梯度；生物量；氮磷同化

中圖分類號：Ｑ９３９．９６ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）01－0056-04

Ｔｈｅ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ａ Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ Strain

ＬＩＵ Ｍｉｎ，ＬＩＡＮＧ Ｙｕｎ－ｘｉａｎｇ，ＺＨＡＯ Ｓｈｕ－ｍｉａｏ，ＸＩＥ Ｙｉ－ｔｉａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａzｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ effect of different nutriednt types on ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｆ ａ Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ｓｔｒａｉｎ was ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＫＨ２ＰＯ４ ｗａｓ ａ ｎｏｔａｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ affecting ｔｈｅ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ． Ｉｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｂｉｏｍａｓｓ， ｔｈｅ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｒ. ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ｆｏｒ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｕｌｄ raise up ｔｏ ４8．02％ ａｎｄ ７．76％ instead of 32．51％ ａｎｄ ５．９８％ respectively， ｗｈｅｎ the content of ＮＨ４Ｃｌ ｗａｓ ０．０５ ｇ／Ｌ， ＫＨ２ＰＯ４ ｗａｓ １．４０ ｇ／Ｌ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ １．０0 ｇ／Ｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ； ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ； ｂｉｏｍａｓｓ； ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ of ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ

目前，沼澤紅假單胞菌被廣泛應(yīng)用于海水、淡水魚類、蝦類及貝類等的養(yǎng)殖和育苗，它能將水體中的有機(jī)質(zhì)和氮磷等物質(zhì)同化為菌體成分存在于水中，同時(shí)消解硫化物［１］，減少水體污染物，減少有毒分解產(chǎn)物［２，３］。沼澤紅假單胞菌還能與異養(yǎng)微生物共同作用，高效率地降解廢水中的有機(jī)物，同時(shí)還能調(diào)節(jié)水體的ｐＨ在適宜的范圍內(nèi)，增加水體中的溶解氧含量［４］。有學(xué)者曾對沼澤紅假單胞菌的氮磷代謝生理特性進(jìn)行了研究，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道沼澤紅假單胞菌具有降氮除磷的能力［３，５］，固定化的沼澤紅假單胞菌對廢水中氮磷的去除率可以分別達(dá)到６１．９％和７３．０％［６］。但對于沼澤紅假單胞菌同化氮磷適宜條件的研究相關(guān)報(bào)道較少，而且也不是很全面。為此，對保藏的一株沼澤紅假單胞菌的氮磷同化能力在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行了初步研究。

１ 材料與方法

１．１ 試驗(yàn)材料

１．１．１ 菌種 沼澤紅假單胞菌（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院發(fā)酵工程室保藏。

１．１．２ 光合細(xì)菌初始培養(yǎng)基 ＮａＣｌ ５．００ ｇ，ＮＨ４Ｃｌ １．００ ｇ，酵母抽提物 １．００ ｇ，ＣＨ３ＣＯＯＮａ·３Ｈ２Ｏ ５．００ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．７５ ｇ，Ｈ２Ｏ １ ０００ ｍL，溶解后調(diào)ｐＨ至７．０，高壓、１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

１．２ 試驗(yàn)方法

１．２．１ 培養(yǎng)基不同濃度梯度影響試驗(yàn) 配制不同濃度梯度培養(yǎng)基：將初始濃度培養(yǎng)基分別稀釋２０、４０、６０、８０和１００倍，調(diào)ｐＨ為７．０。以１０％（Ｖ／Ｖ）的接種量將沼澤紅假單胞菌種子液（只含菌體）接入容積為５５０ ｍＬ的帶膠塞透明玻璃瓶中，內(nèi)含稀釋培養(yǎng)基５００ ｍＬ，置于２８ ℃恒溫培養(yǎng)室中用４０ Ｗ白熾燈連續(xù)光照培養(yǎng)5 d。每一濃度梯度３個(gè)平行，每天取樣測定培養(yǎng)基中殘留的氮磷量（菌體已濾除）。

１．２．２ 不同營養(yǎng)成分的單因素試驗(yàn)

１）ＮＨ４Ｃｌ對沼澤紅假單胞菌同化氮磷的影響。將初始培養(yǎng)基中的ＮＨ４Ｃｌ分別稀釋２０、４０、６０、８０和１００倍，其他組分不變，按照１．２．１的方法進(jìn)行培養(yǎng)，5 ｄ后測定其ＯＤ６６０nm及ＴＮ、ＴＰ同化率。

２）ＫＨ２ＰＯ４對沼澤紅假單胞菌同化氮磷的影響。將ＫＨ２ＰＯ４分別按０．３５、０．７０、１．０５、１．４０和１．７５ ｇ／Ｌ添加于培養(yǎng)基中，其他組分不變，按照１．２．１的方法進(jìn)行培養(yǎng)，5 ｄ后測定其ＯＤ６６０nm及ＴＮ、ＴＰ同化率。

３）酵母抽提物對沼澤紅假單胞菌同化氮磷的影響。將酵母抽提物分別按０．６０、０．８０、１．００、１．２０和１．４０ ｇ／Ｌ添加于培養(yǎng)基中，其他組分不變，按照１．２．１的方法進(jìn)行培養(yǎng)，5 ｄ后測定其ＯＤ６６０nm及ＴＮ、ＴＰ同化率。

１．２．３ 不同營養(yǎng)成分的正交試驗(yàn) 在沼澤紅假單胞菌生長過程中，直接影響氮磷同化率的因子分別為ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨ２ＰＯ４和酵母抽提物。為研究ＫＨ２ＰＯ４、酵母抽提物和作為氮源的ＮＨ４Ｃｌ對沼澤紅假單胞菌生長培養(yǎng)基的綜合效應(yīng)，進(jìn)行Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)（表１）。

１．２．４ 驗(yàn)證試驗(yàn) 將沼澤紅假單胞菌種子液（只含菌體）以１０％（Ｖ／Ｖ）接種量分別接入初始培養(yǎng)基和改良后的培養(yǎng)基內(nèi)，每種培養(yǎng)基做３個(gè)平行。２８ ℃下用４０ Ｗ白熾燈連續(xù)光照培養(yǎng)5 ｄ后，測其ＯＤ６６０nm及ＴＮ、ＴＰ同化率。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 培養(yǎng)基不同濃度梯度對沼澤紅假單胞菌同化氮磷的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，沼澤紅假單胞菌開始繁殖，初始培養(yǎng)基中的氮磷殘留量逐漸下降，5 ｄ時(shí)沼澤紅假單胞菌吸收氮磷的含量分別為98.73、23.76 mg/L（圖1）。隨著稀釋倍數(shù)的不斷增加，培養(yǎng)基中殘留氮素呈先下降后上升的趨勢，拐點(diǎn)出現(xiàn)在接種后第二或第三天，而培養(yǎng)基中磷素變化較小。

試驗(yàn)結(jié)果表明，沼澤紅假單胞菌首先利用培養(yǎng)基中的氮磷合成自身組分，滿足自身生長繁殖需要。隨著營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，菌體之間形成競爭關(guān)系而使部分菌體因營養(yǎng)貧乏而死亡，其體內(nèi)氮磷又釋放到培養(yǎng)基中，因此形成培養(yǎng)基殘余氮磷濃度先降后升的趨勢。

在稀釋１００倍時(shí)，培養(yǎng)基氮濃度較為接近湖水中的實(shí)際情況，其拐點(diǎn)在第二天出現(xiàn)，表現(xiàn)得較為提前，說明該菌株在實(shí)際應(yīng)用過程中，投菌后兩天內(nèi)除氮效率最高。這為如何更加經(jīng)濟(jì)地使用沼澤紅假單胞菌提出了新的研究思路。

２．２ 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

２．２．１ ＮＨ４Ｃｌ對沼澤紅假單胞菌同化氮磷的影響 隨著ＮＨ４Ｃｌ稀釋倍數(shù)的增加，沼澤紅假單胞菌的生物量在稀釋０～６０倍內(nèi)變化不大，而在稀釋２０倍即濃度為０．０５ ｇ／Ｌ時(shí)，TN的同化率最高，達(dá)到42.08%，TP的同化率也處于一個(gè)相對較高值，達(dá)到5.11%（圖2）。因此，綜合考慮選擇稀釋２０倍即濃度為０．０５ ｇ／Ｌ的ＮＨ４Ｃｌ較好。

２．２．２ ＫＨ２ＰＯ４對沼澤紅假單胞菌同化氮磷的影響 隨著ＫＨ２ＰＯ４濃度的增加，沼澤紅假單胞菌菌體逐漸增大。當(dāng)培養(yǎng)基中ＫＨ２ＰＯ４的濃度為１．４０ ｇ／Ｌ時(shí)，其菌體生長和添加１．７５ ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４時(shí)無顯著差異；當(dāng)ＫＨ２ＰＯ４濃度為１．０５ ｇ／Ｌ和１．４０ ｇ／Ｌ時(shí)，TN同化率分別達(dá)到43.28%和41.74%，TP同化率也達(dá)到了6.34%和5.26%（圖3）。因此在保證發(fā)酵生物量的前提下，選擇ＫＨ２ＰＯ４ １．４０ ｇ／Ｌ的濃度比較好。

２．２．３ 酵母抽提物對沼澤紅假單胞菌同化氮磷的影響 隨著酵母抽提物濃度的增加，沼澤紅假單胞菌逐漸生長。當(dāng)培養(yǎng)基中酵母抽提物的濃度為１．０ ｇ／Ｌ時(shí)，ＴＮ、ＴＰ的同化率最高，分別達(dá)到４１．４６％和５．５４％（圖4），同時(shí)菌體生長與添加１．２和１．４ ｇ／Ｌ酵母抽提物時(shí)無顯著差異。因此，從經(jīng)濟(jì)上考慮，選擇添加１．０ ｇ／Ｌ的酵母抽提物較好。

２．３ 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇不同水平合理安排正交試驗(yàn)。通過極差、均值分析，可以得出沼澤紅假單胞菌氮磷同化率的最優(yōu)結(jié)果及主要影響條件。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，Ｂ因素（ＫＨ２ＰＯ４）是影響沼澤紅假單胞菌氮磷同化率的主要因素。這可能是由于沼澤紅假單胞菌的生長繁殖需要一定濃度的磷元素。沼澤紅假單胞菌對磷的同化率較低，因此在分析中以ＴＮ同化率作為主要判斷依據(jù)，從而選出最優(yōu)水平組合為Ａ２Ｂ２Ｃ２，即選擇ＮＨ４Ｃｌ ０．０５ ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １．４０ ｇ／Ｌ，酵母抽提物１．０ ｇ／Ｌ（表2）。

２．４ 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，初始條件下培養(yǎng)基中氮磷濃度分別由３０３．６９ ｍｇ／Ｌ、３９７．２５ ｍｇ／Ｌ下降到２０４．９６ ｍｇ／Ｌ、３７３．４９ ｍｇ／Ｌ，氮磷同化率分別為３２．５１％和５．９８％。而優(yōu)化后可以在保證沼澤紅假單胞菌發(fā)酵生物量的前提下降低氮磷濃度的起始量，培養(yǎng)基中氮磷濃度分別由１１８．６４ ｍｇ／Ｌ、３１７．８０ ｍｇ／Ｌ下降到６１．６７ ｍｇ／Ｌ、２９３．１３ ｍｇ／Ｌ，氮磷同化率分別為４８．０２％和７．７６％（圖5）。

３ 小結(jié)與討論

在滿足最大發(fā)酵生物量的情況下，沼澤紅假單胞菌生長培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分分別為ＮＨ４Ｃｌ ０．０５ ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．４０ ｇ／Ｌ、酵母抽提物１．００ ｇ／Ｌ時(shí)，可以提高該菌對培養(yǎng)基中氮磷的同化效率，其分別達(dá)到４8．02％和７．76％。

周茂洪等［３］研究的試驗(yàn)結(jié)果表明沼澤紅假單胞菌具有一定同化磷的能力，可以將培養(yǎng)基中的無機(jī)磷同化為有機(jī)磷。在以乙酸鈉或蘋果酸為碳源的條件下，沼澤紅假單胞菌可同化２０ ｍｇ／Ｌ左右的磷。試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，同時(shí)還增加了沼澤紅假單胞菌對氮素同化能力的研究。

試驗(yàn)中，研究的是沼澤紅假單胞菌在培養(yǎng)基中的氮磷轉(zhuǎn)化效率，未涉及到其在實(shí)際湖水中的氮磷同化能力。在實(shí)際湖水中，其他不同種群微生物的共同作用［７］、藻類的競爭［８］、浮游動(dòng)物［９］和魚類的捕食［１０］等都會(huì)不同程度地影響沼澤紅假單胞菌對氮磷的轉(zhuǎn)化效率，所以應(yīng)在今后進(jìn)行進(jìn)一步探究。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 董秋明．利用光合細(xì)菌降解有機(jī)廢水中硫化物的初步探究［Ｊ］．環(huán)境與開發(fā)，１９９８，１３（１）：２２－２４．

［２］ 何劍丹，龍炳清，劉長根，等．光合細(xì)菌的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景［Ｊ］．四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００５，２８（１）：１１４－１１６．

［３］ 周茂洪，趙肖為，吳學(xué)昌．光合細(xì)菌沼澤紅假單胞菌同化磷能力的研究［Ｊ］．科學(xué)通報(bào)，２００２，１８（２）：１４２－１４６．

［４］ 丁愛華．光合細(xì)菌調(diào)控水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)水質(zhì)的研究［Ｊ］．農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，２０００，１９（６）：３３９－３４１，３４４．

［５］ 常會(huì)慶，王世華，寇太記，等．固定化光合細(xì)菌對水體富營養(yǎng)化的去除效果［Ｊ］．水資源保護(hù)，２０１０，２６（３）：６４－６７．

［６］ 劉 影．光合細(xì)菌的增殖培養(yǎng)及其處理城市污水中氮磷的研究［Ｄ］．青島：中國海洋大學(xué)，２００６．

［７］ 季 明．人工復(fù)合細(xì)菌對水體污染凈化效果的實(shí)驗(yàn)研究［Ｊ］．天津城市建設(shè)學(xué)院學(xué)報(bào)，２００２，８（１）：１－４．

［８］ 李保珍，馮 佳，謝樹蓮．光合細(xì)菌對銅綠微囊藻生長的抑制效應(yīng)［Ｊ］．生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，２００９，１８（５）：１７３６－１７４０．

［９］ 韓士群，范成新，嚴(yán)少華．固定化微生物對養(yǎng)殖水體浮游生物的影響及生物除氮研究［Ｊ］．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，２００６，１２（２）：２５１－２５４．

［１０］ 張滿隆， 楊紹斌， 潘 玉． 光合細(xì)菌及其在魚類養(yǎng)殖中的應(yīng)用［Ｊ］．水利漁業(yè)，２００２，２２（３）：６－７．