實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)檢測尿液中沙眼衣原體的分析

[摘要] 目的 評價實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)（SAT）檢測尿液中沙眼衣原體（CT）的特異性和敏感性。方法 對175例疑似患者生殖道拭子行CT-SAT、PCR檢測和沙眼衣原體培養(yǎng)，同時對對應(yīng)的175份尿液標(biāo)本行CT-SAT檢測。結(jié)果 SAT對同一患者的拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本的檢測結(jié)果符合率100%。1例淋球菌培養(yǎng)陰性而SAT陽性，2例PCR陽性而SAT陰性。結(jié)論 SAT技術(shù)檢測拭子及尿液中的沙眼衣原體具有很高的靈敏度和特異性，為CT的實驗室診斷提供新的檢測方法。

[關(guān)鍵詞] 沙眼衣原體；SAT； PCR；培養(yǎng)；尿液

[中圖分類號] R374.1 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）22-124-02

Real-time Fluorescence Detection of Nucleic Acid Amplification Constant Urine Analysis of Chlamydia Trachomatis

SUN Yuhua CHEN Feng CAI Ruiyun

Guangji Hospital in Dongguan City of Guangdong Province，Dongguan 523690，China

[Abstract] Objective To evaluate the real-time isothermal nucleic acid amplification fluorescence（SAT） Chlamydia trachomatis in urine（CT） of the specificity and sensitivity. Methods 175 cases of suspected patients of genital swab line CT-SAT，PCR testing and Chlamydia trachomatis culture，while the corresponding urine specimens of 175 CT-SAT test. Results SAT on the same source swab specimens and urine samples consistent results：Case of SAT-positive and N.gonorrhoeae culture-negative，2 SAT-negative and PCR positive. Conclusion SAT swabs and urine detection of Chlamydia trachomatis with high sensitivity and specificity of laboratory diagnosis for the CT to provide a new detection method.

[Key words] Chlamydia trachomatis； SAT； PCR； Culture；Urine

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT）是將新一代的核酸恒溫擴增技術(shù)和實時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)，該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

CT-SAT試劑盒由上海仁度生物科技有限公司提供，PCR試劑盒由深圳匹基生物工程有限公司提供，沙眼衣原體培養(yǎng)使用Mc Coy培養(yǎng)皿，實時熒光核酸擴增儀為杭州博日科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 標(biāo)本來源

2009年9月～2010年7月來本院就診的疑似患者175例，其中男62例，女113例，每份患者取3份分泌物拭子標(biāo)本和1份尿液標(biāo)本。

1.3 標(biāo)本采集

準(zhǔn)備3個無菌拭子，分別以A、B、C標(biāo)示。B號拭子的管內(nèi)加入1mL無菌生理鹽水，C號拭子的管內(nèi)加入1.5mL無菌生理鹽水。患者采樣前2h不排尿，取材方法按常規(guī)操作[1]。即男性患者由尿道口內(nèi)3cm處、女性患者由宮頸口內(nèi)1～1.5cm處取材。棉拭插至取材處后，轉(zhuǎn)動并停留數(shù)秒種后取出。A拭子用于淋球菌培養(yǎng)，1h內(nèi)盡快接種。B拭子取后-20℃冰箱保存，作PCR測定待用。C拭子取后取1mL混合液至專用尿液保存液（試劑盒提供）中，混勻，-20℃冰箱保存，作CT- SAT測定待用。另取1mL首段尿液至專用尿液保存液（試劑盒提供）中混勻，-20℃冰箱保存，用于CT-SAT測定待用。

1.4 檢測方法

尿液標(biāo)本和拭子標(biāo)本從冰箱取出，平衡至室溫同時行CT-SAT檢測，按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 沙眼衣原體培養(yǎng)

見參考文獻[1]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS10.0軟件對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 SAT、PCR及沙眼衣原體培養(yǎng)的檢測

SAT檢測的陽性63例尿液標(biāo)本其對應(yīng)的63例拭子標(biāo)本SAT檢測也是陽性，符合率100%，1例沙眼衣原體培養(yǎng)陰性而SAT陽性，2例PCR陽性而SAT陰性。尿液標(biāo)本不適用于PCR和沙眼衣原體培養(yǎng)，故均以拭子結(jié)果為參照[4]。見表1。

2.2 CT-SAT檢測的敏感性及特異性

與沙眼衣原體培養(yǎng)結(jié)果作比較，CT-SAT尿液/拭子標(biāo)本的檢測靈敏度為98.41%（62/63），特異性為99.11%（112/113），經(jīng)χ2檢驗，差異無顯著性（χ2=0.01，P＞0.05）；與PCR結(jié)果作對比，CT-SAT尿液/拭子標(biāo)本的檢測靈敏度為100%（63/63），特異性為98.21%（110/112），經(jīng)χ2檢驗，差異無顯著性（χ2=0.05，P＞0.05）。見表1。

2.3 CT-SAT法對拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本檢測結(jié)果的符合率分析

CT-SAT法對175例患者的拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本進行檢測，兩組標(biāo)本檢測結(jié)果的符合率為100%，差異無顯著性（P＞0.05）。

3 討論

目前CT檢測都是以患者的泌尿生殖道分泌物進行沙眼衣原體抗原檢測、沙眼衣原體培養(yǎng)和/或PCR檢測。取生殖道分泌物容易增加患者的取樣痛苦，同時幾種檢測方法在敏感性和特異性上都有不足。沙眼衣原體抗原檢測多用膠體金試劑，陽性率都較低容易造成女性患者尿道感染的漏檢。沙眼衣原體培養(yǎng)的敏感性和特異性都較好，但是耗時長。PCR檢測的是DNA，患者治療后病灶處殘留的DNA包括殺死后還沒排出的菌體DNA都會導(dǎo)致PCR陽性結(jié)果。病人經(jīng)治療后病菌死亡、癥狀消失即可判為治愈，如果要等PCR轉(zhuǎn)陰，勢必造成過度治療[2]。本研究中有2例PCR陽性而CT-SAT及沙眼衣原體培養(yǎng)均陰性就是這種情況。CT-SAT檢測病原菌體RNA，RNA在死亡的病原體中快速降解，活菌中才有完整的RNA片段，故能排除患者治療后病灶處的殘留物對檢測結(jié)果的影響，有利于臨床用藥后的療效監(jiān)測及判愈。在175例標(biāo)本中1例CT-SAT陽性，而沙眼衣原體培養(yǎng)陰性，可能是沙眼衣原體培養(yǎng)敏感性不足的原因，此例標(biāo)本經(jīng)PCR實驗后得到驗證，也證明了CT-SAT的高靈敏度。而且CT-SAT可以對尿液標(biāo)本進行檢測，尿液作為一種非侵入性的取樣標(biāo)本，取樣方便，減少了患者采樣的痛苦，也減少了醫(yī)生的工作量[3]。RNA在環(huán)境中極不穩(wěn)定，容易降解，大大降低了交叉污染概率及環(huán)境污染[4]。

本研究顯示，利用SAT技術(shù)檢測沙眼衣原體，不僅特異性好，靈敏度高，可用于臨床用藥后的療效監(jiān)測及判愈，而且尿液標(biāo)本可以代替拭子標(biāo)本。在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出采樣方便、耗時短、低污染、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，為沙眼衣原體的實驗室診斷提供新的采樣方式和檢測方法[5]，是一種值得推廣的檢測方法。

[參考文獻]

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[2]葉順章，王千秋，王荷英，等. PCR檢驗技術(shù)在性病臨床標(biāo)本實驗診斷中應(yīng)用價值的研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2002，16（1）：6-8.

[3] 王彬.泌尿生殖道支原體感染的特征及藥敏結(jié)果分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17（4）：123-124.

[4] Lowe P，Oloughin P，Evans，et al.Comparison of the gen-probe APTMA Combo-assay to the AMPL ICOR CT/NG assay for detection of Chlam ydia trachamatis and neisseria gonorrhoeae in urine samples from Austrlian men and women[J].J Clin Microbiol，2006，44（7）：2619-2621.

[5] 王寶璽，朱學(xué)駿，倪安平，等.細(xì)胞培養(yǎng)、連接酶鏈反應(yīng)和六種聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒檢測沙眼衣原體的比較研究[J].中華皮膚科雜志，2001，343：181-183.

（收稿日期：2011-03-10）