冬蟲夏草對延緩糖尿病腎病腎小球系膜細胞增殖的研究

[摘要] 目的 探討傳統中藥冬蟲夏草對糖尿病腎病（DN）腎小球系膜細胞增殖的影響及該藥延緩DN進展的作用機制。方法 選取人腎小球系膜細胞（HMC）為研究對象，運用細胞培養實驗方法，觀察高糖刺激下HMC的增殖變化，并運用中藥冬蟲夏草發酵菌粉藥物血清進行體外干預，觀察中藥冬蟲夏草發酵菌粉對高糖培養下HMC增殖的影響，并運用MTT比色法檢測細胞存活和生長、運用反轉錄RT-PCR（reverse transcription PCR）方法檢測TGF-β1基因。 結果 冬蟲夏草及福辛普利藥物血清干預后24h和48h后，對高糖培養細胞增殖具有不同程度抑制，在相同作用時間下各冬蟲夏草藥物血清高、中、低劑量組與正常對照組比較具有統計學意義（P＜0.01）；與高糖組比較具有統計學意義（P＜0.01），通過高糖培養mRNA的表達增加，明顯高于正常對照組（P＜0.05）。結論 冬蟲夏草發酵菌粉延緩DN進展可能是通過抑制高糖下HMC的增殖、下調TGF-β1基因表達延緩腎小球硬化實現的。

[關鍵詞] 冬蟲夏草；糖尿病腎病；腎小球系膜細胞

[中圖分類號] R285.5；R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號]1673-9701（2011） 22-11-02

The Effects of Cordyceps on Human Mesangial Cells（HMCs） in Diabetic Nephropathy

SHI Haitao 1 YANG Qingchun1 WANG Xuefeng 2 YU Haitao1 GUO Chunling1 PAN Shujie1 DONG Chunling1

1.Department of Nephrology， Daqing Longnan Hospital of Daqing Oil Field General Hospital，Daqing 163000， China；2. Rehabilitation Department， Daqing Oil Field General Hospital， Daqing 163000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Dongchongxiacao on human mesangial cells（HMCs） cultured in vitro and explore the nephroprotective mechanism of Dongchongxiacao for diabetic nephropathy. Methods We get the rats serum with different concentration of medicine，and then study the effects of the serum on HMCs. the HMCs proliferation was assessed by MTT assay. RT-PCR was used to detect the expression of transforming growth factor beta 1mRNA（TGF-β1mRNA）. Results The high-dose serum can inhibit the proliferation of mesangial cells under high glucose condition at 24h，48h （P＜0.01）， The expression of TGF-β1mRNAof the high-dose are higher than control group（P＜0.05）. Conclusion Dongchongxiacao not only can inhibit high glucose-induced proliferation of HMCs，but also can decrease the secretion of TGF-β1，so to delay the progression of DN.

[Key words] Dongchongxiacao ；DN；Human mesangial cell

糖尿病腎病（dfiabetic nephropathy，DN）即糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病重要的微血管慢性并發癥之一，也是導致終末期腎功能衰竭的主要原因。DN在全球范圍內呈上升趨勢，在西方國家DN成為終末期腎病（ESRD）的首位原因[1]。因此，對DN早發現早治療，探尋有效地阻止DN進程的藥物仍是腎病工作者的重要任務。本研究通過對傳統中藥冬蟲夏草延緩糖尿病腎病腎小球系膜細胞增殖的研究，探討該藥對DN早期影響。

1 資料與方法

1.1 試驗分組

將購買的人腎小球系膜細胞株進行細胞復蘇、細胞培養、細胞傳代后，選用3～10代經過鑒定的細胞隨機分為正常對照組、高糖組、冬蟲夏草藥物血清高、中、低劑量組、福辛普利組（每組各6份細胞），采用高糖模型進行研究。

1.2 試驗用藥以及細胞株

冬蟲夏草發酵菌粉由江西金水寶制藥有限公司提供，福辛普利（蒙諾）：規格：10mg/片；批號：070511。由中美上海施貴寶制藥有限公司生產。人腎小球系膜細胞（HMC）購自武漢原生原代（PriCells）生物醫藥科技有限公司。

1.3 實驗藥物血清的制備

健康雄性SD大鼠50只，體重（200±10）g，隨機分為5組，即正常對照組、福辛普利組、冬蟲夏草藥物血清高、中、低劑量組。灌胃給藥，正常組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續給藥7d。給藥期間，在末次灌胃2h后麻醉，在無菌條件下經腹主動脈采血，3000rpm，離心15min后取血清，56℃水浴30 min滅活補體，經0.22μm孔徑的針頭濾器過濾除菌，分裝-20℃凍存備用。

1.4 主要試劑和相關配液

改良型RPMI-1640培養基、MTT、胎牛血清、胰酶、二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素；Trizol、反轉錄試劑盒、Taq酶、PCR Marker、瓊脂糖、TGF-β1和β-actin引物。BECKMAN GS-15R centrifuge 低溫高速離心機、電熱鼓風干燥箱、紫外分光光度、PCR擴增儀、水平電泳儀、凝膠成像分析系統。

1.5 引物設計與合成

根據GENEBANK中人TGF-β1、β-actin cDNA已知序列應用引物設計軟件Primer5.0設計引物，由上海申工基因技術公司合成。

TGF-β1：上游引物：F5′-AGC GAC TCG CCA GAG TGG TTA-3′；下游引物：R5′-GCA GTG TGT TAT CCC TGC TGT CA-3′。

β-actin：上游引物： 5′-GTC CTC TCC CAA GTC CAC AC-3′；下游引物： 5′-GGG AGA CCA AAA GCC TTC AT-3′。

1.6 實驗方法

人腎小球系膜細胞需要經過細胞復蘇、細胞培養、細胞傳代和細胞凍存等步驟，由相差顯微鏡觀察以及間接免疫熒光染色進行鑒定確認后，將制備好的含藥血清干預各實驗分組，經過藥物功能干預后的HMC，應用MTT法檢測細胞增殖情況，采用酶標儀在490nm波長處各孔測吸光度（A）值。

1.7 RT-PCR方法檢測mRNA的表達

取出細胞培養瓶，倒掉原液，經過將系膜細胞提取總RNA、測定提取的總RNA量、擴增產物的鑒定－瓊脂糖凝膠電泳分析：用VILBER LOURMAT型成像系統進行分析，分別測量TGF-β1和β-actin電泳條帶的光密度和面積，以TGF-β1、與β-actin比值代表TGF-β1基因mRNA表達水平。

1.8 統計學處理

實驗數據用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，實驗結果以均數±標準差（χ±s）表示，多組間數據比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較方差齊用配對t檢驗，方差不齊用Dunnett’s檢驗。以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

冬蟲夏草及福辛普利藥物血清干預后24h和48h后，對高糖培養細胞增殖具有不同程度抑制，在相同作用時間下其各組與正常對照組比較具有統計學意義（P＜0.05或P ＜0.01）；與高糖組比較具有統計學意義（P ＜0.05或P ＜0.01），通過RT-PCR方法檢測mRNA的表達，說明正常人腎小球系膜細胞存在TGF-β1 mRNA表達，說明TGF-β1參與是細胞生理活動；通過高糖培養mRNA的表達增加，明顯高于正常對照組。說明高糖狀態刺激腎小球系膜TGF-β1的表達。見表1、表2。

3 討論

冬蟲夏草是一種名貴的藥用真菌，屬肉座菌目麥角菌科蟲草屬植物，為蟲草菌的子座與其寄主蝙蝠蛾幼蟲尸體的復合物，俗稱蟲草。隨著科學技術的不斷進步與發展，近年來冬蟲夏草用以治療DN受到臨床和許多學者重視。它含有豐富的蛋白質、多種氨基酸、糖類、醇類、核昔類、維生素、微量元素、有機酸等成分[1]。研究發現冬蟲夏草可通過降低鏈脲佐菌素所致糖尿病動物模型血肌酐、血膽固醇、血Ⅳ型膠原水平抑制腎組織纖維化，減輕腎臟病理變化對早期糖尿病腎病大鼠腎損傷，起一定保護作用[2-4]。此外，冬蟲夏草對高糖環境下腎小球系膜細胞（GMC）分泌的CoI、CoIIV、纖維連接蛋白、透明質酸及層粘連蛋白有明顯抑制作用，抑制GMC肥大和細胞外基質（ECM）合成增加，有望用于糖尿病腎病防治[5]。

TGF-β1是一種與DN發病密切相關的生長因子，可促進ECM合成，抑制基質降解，參與了腎間質纖維化的各個環節，在DN腎小球硬化和系膜基質堆積中起著關鍵作用。高血糖刺激ECM的形成主要是通過TGF-β途徑，Oh等[6]研究顯示，高糖與大鼠腎小球系膜細胞培養6h即可顯著增加TGF-βmRNA表達并繼續增加至48h，TGF-βmRNA在6h時為對照的1.5倍，高糖不僅刺激TGF-β的產生，亦可上調TGF-β受體。

本研究結果顯示，冬蟲夏草及福辛普利藥物血清干預后24h和48h后，對高糖培養細胞增殖具有不同程度抑制，在相同作用時間下冬蟲夏草各劑量組與正常對照組比較具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01 ）；與高糖組比較具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），通過RT-PCR方法檢測mRNA的表達，說明正常人腎小球系膜細胞存在TGF-β1mRNA表達，說明TGF-β1參與是細胞生理活動；通過高糖培養mRNA的表達增加，明顯高于正常對照組。說明高糖狀態刺激腎小球系膜TGF-β1的表達。而冬蟲夏草及福辛普利藥物血清干預后，可以顯著抑制TGF-β1mRNA的基因表達，通過本實驗結果推測冬蟲夏草發酵菌粉可能是通過抑制高糖下HMC的增殖、下調TGF-β1基因表達延緩腎小球硬化[7]。但本研究僅通過對傳統中藥冬蟲夏草延緩糖尿病腎病腎小球系膜細胞增殖進行初步探討，其對DN的腎臟保護作用機制遠未明確，尚有待更為全面、系統、深入的研究。

[參考文獻]

[1] 白秀文.冬蟲夏草的藥用價值及臨床應用[J].中國醫藥導報，2006，3（30）：80.

[2] 崔海月.冬蟲夏草對糖尿病腎病大鼠腎損傷的保護作用研究[J].延邊大學醫學學報，2006，29（4）：252-255.

[3] 龔偉，黎磊石，陳丹，等.百令（冬蟲夏草）對糖尿病大鼠轉化生長因子β及其受體表達的影響[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2006，15（4）：329-339.

[4] 胡楊青，周巧玲，劉抗寒，等.冬蟲夏草對糖尿病腎病鼠腎組織轉化生長因子表達的影響[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2005，14（5）：413-417.

[5] 肖朝華，周建華，吳衡生.多球殼菌素對高糖誘導腎小球系膜細胞肥大及細胞外基質合成的影響[J].實用兒科臨床雜志，2006，21（5）：268-270.

[6] Oh JH，Ha H，Yu MR，et al. Seqiential effects of high glucose on messangial cell transforming growth factor-beta 1 and fibronectin synthesis[J]. Kidney Int，1998（3），54：1872-8

[7] 高玉梅，劉國平. 冬蟲夏草對腎臟的保護作用研究進展[J].醫學綜述2010，16（2）：289.

（收稿日期：2010-08-18）