MTT法對大腸癌的藥敏實驗及臨床應用研究

[摘要] 目的 探討用MTT法測定大腸癌細胞對化療藥物體外敏感性，研究大腸癌藥敏的異質性和個體化療的可行性。方法 用MTT法檢測40份大腸癌標本對氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑（L-OHP）、伊立替康（CPT）單藥應用、兩藥及三藥（全量或半量）聯合應用的敏感性。結果 不同標本的藥物敏感性存在明顯差異，單藥中最有效的藥物依次為伊立替康、奧沙利鉑和氟尿嘧啶，敏感率分別為35.0%、27.5%和20.0%；兩藥聯合應用均優于各自單藥的抑制效果（P＜0.05），伊立替康聯合奧沙利鉑弱于伊立替康或奧沙利鉑與氟尿嘧啶聯合的抑制效果（P＜0.05）；三藥聯合應用的抑制效果顯著優于兩藥聯合（P＜0.05），三藥全量及半量聯合應用效果差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 大腸癌對抗癌藥物的敏感程度普遍較低，且存在明顯異質性。試驗結果與臨床治療經驗比較一致，MTT可用于為大腸癌患者選擇合適的化療藥物。由氟尿嘧啶、奧沙利鉑及伊立替康的聯合應用具有高效協同抑制大腸癌細胞的作用，可為臨床難治性和復發性大腸癌患者的化療提供參考。

[關鍵詞] MTT法；大腸癌；藥物敏感性

[中圖分類號] R446.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）22-26-03

Clinical Application and Evaluation of Chemosensitivity of Human Colorectal Cancer Determined by MTT Assay in Vitro

YANG Leilei1 DAI Yuechu2 DONG Milian2 YE Pubo1 LIAO Wei1 MEI Tong1

1.Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China；2.Affilicated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical College，Linhai 317000，China

[Abstract] Objective To investigate the heterogeneity of chemo sensitivity in colorectal cancer using an MTT assay and the feasibility of individual chemotherapy. Methods The growth-inhibition effects of irinotecan（CPT），oxaliplatin（L-OHP） and fluorouracil（5-FU），single drug，two or three drugs on 40 human colorectal carcinoma cells were observed by MTT assay. Results There were considerable differences in chemo sensitivity between individuals. The most active single drugs in the assay was identified as irinotecan（CPT），oxaliplatin（L-OHP）and fluorouracil（5-FU）；35.0%，27.5% and 20.0% of specimens showed sensitivity to them，The inhibitory rates of any two drugs were significantly higher than those in single drug group（P＜0.05）．The growth-inhibition effect of CPT combined with L-OHP was lower than that of CPT or L-OHP combined with 5-Fu（P＜0.05）. The growth-inhibition effect of the three drugs combination was significantly enhanced compared with regiment of two drugs combination chemotherapy（P＜0.05）． Furthermore，whole-dose and half-dose combination of 3 drugs reached similar cell growth inhibitory rate（P＞0.05）. Conclusion There was the heterogeneity of the in vitro chemosensitivity in colorectal cancer. The use of the MTT assay provides a method of selecting appropriate anti-cancer drugs in colorectal cancer. The regiment of three drugs in the 5-FU+L-OHP+CPT can synergistically inhibit the proliferation of human colorectal carcinoma cells，which provided reference for the chemotherapy of refractory and recurrent colorectal carcinoma patients．

[Key words] MTT assay；Colorectal carcinoma；Chemosensitivity

化療是臨床治療惡性腫瘤的重要手段之一，大腸癌中、晚期患者術后需輔助化療。大腸癌普遍存在化療耐藥問題，經驗化療因用藥缺乏客觀依據給患者帶來許多痛苦。為了提高用藥的針對性和敏感性，在化療前進行體外抗腫瘤藥敏性測定顯得尤為重要[1，2]。利用癌細胞原代培養進行藥敏試驗可針對性地指導治療由于大腸癌對化療藥物敏感性存在的個體差異。因此，如何能為患者在化療前篩選出敏感藥物，實現個體化治療，是當前腫瘤學界的主要研究方向。本研究用MTT法對40份新鮮大腸癌手術標本進行了體外藥敏檢測，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集本院2010年3～6月大腸癌手術患者（男23例，女17例；年齡18～88歲，中位年齡53歲）標本40份，經病理證實均為原發腫瘤，且術前未經放化療或免疫治療。其中結腸癌12份（腺癌9份，黏液腺癌2份，印戒細胞癌1份），直腸癌28份（腺癌25份，黏液腺癌2份，乳頭狀管狀腺癌1份）；TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期24份，Ⅲ期14份，Ⅳ期2份。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥品 依據文獻報道血漿峰值藥物濃度（PPC）和預實驗結果確定伊立替康、奧沙利鉑基準實驗濃度（BTC）分別為12.0g/mL、10.0g/mL。聯合用藥時采用伊立替康終濃度為12.0g/mL（全量）和6.0g/mL（半量）、奧沙利鉑為10.0g/mL（全量）和5.0g/mL（半量）。

1.2.2 試劑 培養液RPMI-1640（美國Sigma公司）、10％十二烷基硫酸鈉（SDS長沙科泰科研試劑有限公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、四甲基氮唑藍MTT（美國Sigma公司）、膠原酶（美國Sigma公司）、胰蛋白酶（美國Sigma公司）。

1.3 實驗儀器

全自動酶標儀statFax2100（美國）。CO2培養箱（FORMA 3111美國）。

1.4 體外藥敏試驗

無菌取新鮮大腸癌手術標本，在含抗生素培養基中浸泡20min，剪成0.5～1.0mm3碎塊，置50mL離心管中，加10mL含混合消化酶的培養基，37℃消化1h。200目篩網過濾，獲單細胞懸液，用1640培養基洗2次。臺盼藍染色，計活腫瘤細胞數。大腸癌細胞培養于含20％胎牛血清的1640培養基中，以0.25％胰酶消化后制成1×105/mL細胞懸液，于2個96孔板中每孔接種200μL，37℃、5％CO2飽和濕度的培養箱中培養24h后，于96孔板中加入藥物，測定細胞生長。96孔板分為空白組、對照組和藥物實驗組。藥物實驗組又分為：①單藥組，伊立替康全量、奧沙利鉑全量、氟脲嘧啶全量；②兩藥聯合化療組，伊立替康全量+奧沙利鉑全量、伊立替康全量+氟脲嘧啶、奧沙利鉑全量+氟脲嘧啶；③三藥聯合化療組，伊立替康全量+奧沙利鉑全量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奧沙利鉑半量+氟脲嘧啶、伊立替康全量+奧沙利鉑半量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奧沙利鉑全量+氟脲嘧啶。每組設4個復孔。單藥組加入各自濃度藥物100μL；2種藥物聯合用藥時采用1︰1方案，使藥物濃縮1倍后各加50μL，使每孔的藥物濃度、體積和總量不變；3種藥物聯合應用時，采用1︰1︰1方案，使藥物濃縮2倍后各加25μL，再補加25μL培養基以使藥物濃度及總量不變。置于37℃、5％CO2培養箱48h后，每孔加入MTT 20μL，繼續培養4h，棄培養液，每孔加DMSO 150μL，充分溶解10min。全自動酶標儀（測定波長490nm、參比波長630nm）測定各孔光密度值（OD值），空白組OD＜0.005、實驗組OD＞0.1為有效實驗。

1.5 數據處理

計算平均抑制率（IR），IR＝[1－（用藥組平均OD值－空白組平均OD值）/（對照組平均OD值－空白組平均OD值）]×100％。IR標準采用1978年全國抗癌藥物會議制定的《腫瘤藥物通用指標》IR＜30％為不敏感，歸陰性；30％＜IR＜50％為敏感；IR＞50％為中度敏感，歸陽性。

1.6 統計學處理

用SPSS13.0統計軟件處理，計數資料采用行乘列的卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

不同標本的藥物敏感性存在明顯差異，單藥中最有效的藥物依次為伊立替康、奧沙利鉑和氟尿嘧啶，敏感率分別為35.0%、27.5%和20.0%；兩藥聯合應用均優于各自單藥的抑制效果（P＜0.05），伊立替康聯合奧沙利鉑弱于伊立替康或奧沙利鉑與氟尿嘧啶聯合的抑制效果（P＜0.05）；三藥聯合應用的抑制效果顯著優于兩藥聯合（P＜0.05），三藥全量及半量聯合應用效果差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

3 討論

MTT法是一種近年來研究較廣泛的方法，該方法由Mosman于1983年首創。國內外學者采用MTT法在腫瘤體外藥敏試驗方面積累了一定的臨床和實驗資料，認為該法是簡便、快捷、經濟的藥敏方法，臨床相關性較高[3-5]。不僅對臨床個體化療有重要指導意義，而且在研究抗癌藥物相互作用、耐藥修飾劑對細胞毒性的影響、體外新藥的篩選以及最終實現個體化療方面都有深入研究價值。Tomita K等研究表明，體外藥敏試驗與體內臨床用藥不敏感（陰性結果）相符合率均為90％。由此表明，不論是真陽性及真陰性符合率，應用具有簡便、快速、敏感、結果可靠等優點的MTT法試驗，對于制定臨床腫瘤合理化療策略具有指導意義。

本檢測結果顯示，不同患者大腸癌標本對化療藥物的敏感程度有明顯的異質性。3份未檢測到敏感藥物及藥物組合，4份檢測到對所有藥物及藥物組合均敏感。提示化療前進行體外藥敏檢測，可篩選出患者相對敏感的藥物，以避免盲目用藥的損害。此外，試驗顯示，大腸癌對單藥的敏感性普遍較差，對CPT、L-OHP和5-FU的中度敏感率分別為10.0%、7.5%和2.5%。此結果與大腸癌屬化療低度敏感的臨床觀察相符合。現在，臨床上多用2種或2種以上的藥物進行聯合化療，但發表的體外藥敏試驗結果多是單藥試驗結果，這與臨床實際應用有較大距離。因此，我們嘗試體外檢測臨床常用的三種藥物氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康單藥應用、兩藥及三藥（全量或半量）聯合應用的敏感性。結果顯示，不同標本的藥物敏感性存在著明顯差異，單藥中有效的藥物依次為伊立替康、奧沙利鉑和氟尿嘧啶，敏感率分別為35.0%、27.5%和20.0%；兩藥聯合應用均優于各自單藥的抑制效果（P＜0.05），伊立替康聯合奧沙利鉑弱于伊立替康或奧沙利鉑與氟尿嘧啶聯合的抑制效果（P＜0.05）；三藥聯合應用的抑制效果顯著優于兩藥聯合（P＜0.05），三藥全量及半量聯合應用效果差異無統計學意義（P＞0.05）。

在本實驗中，伊立替康、奧沙利鉑及氟脲嘧啶三藥聯合顯示了強大的抗腫瘤活性，明顯優于伊立替康或奧沙利鉑與氟脲嘧啶的兩藥聯合的效果。Falcone等[5]進行的一項Ⅲ期臨床研究表明，應用伊立替康、奧沙利鉑及氟脲嘧啶三藥聯合的FOLFOXIRI方案治療晚期轉移性大腸癌顯示出較好的抗腫瘤活性，與伊立替康、氟脲嘧啶二藥聯合FOLFIRI方案相比在RR、PFS和OS均取得明顯的改善。

國外也有研究表明，三者聯合應用可能通過協同作用而增強抗腫瘤效果。本實驗顯示，半量與全量的三藥聯合組內差異不顯著，既半量聯合可取得全量聯合應用相同的效果。這種半量的化療方案可以在保證療效的前提下減少毒副作用，為臨床應用三藥小劑量化療提供了實驗依據。但我們檢測藥敏的病例數較少，尚需更多的數據和進一步研究，才能為臨床應用提供更有價值的試驗依據。

[參考文獻]

[1] Letwin R．Chemosensitivity testing[J]．Clin J Oncol Nurs，2001，5（5）：195-200．

[2] Untch M，Ditsch N，Langer E，et al．Chemosensitivity testing in gynecologic oncology—dream or reality?[J]．Recent Resuits Cancer Res，2003，161：146-158．

[3] Cao W，Yang W，Lou G，et al. PhaseⅡtrial of infusional fluorouracil，leucovorin，oxaliplatin，and irinotecan（FOLFOXIRI）as first-line treatment for advanced gastric cancer[J]. Anticancer Drugs，2009，20（4）：287-293.

[4] Douillard JY，Siena S，Cassidy J，et al. Randomized， phaseⅢ trial of panitumumab with infusional fluorouracil，leucovorin，and oxaliplatin （FOLFOX4）versus FOLFOX4 alone as first-line treatment in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer：the prime study[J]. J Clin Oncol，2010，28（31）：4697-4705.

[5] Falcone A，Ricci S，Brunetti I，et al. Phase Ⅲ trial of infusional fluorouracil，leucovorin，oxaliplatin，and irlnoteean（FOLFOXIRI）compared with infusional fluorouracil，leucovorin，and irinoteean（FOLFIRI）as first-line treatment for metastatic colorectal cancer：the Gruppo Oncologico Nord Ovest[J]．J Clin Oncol，2007，25（13）：1670-1676.

（收稿日期：2011-05-30）