膠體金檢測抗環瓜氨酸肽抗體性能評價

[摘要] 目的 對膠體金免疫層析（GICA）技術檢測患者血清抗環瓜氨酸肽（CCP）抗體進行性能驗證和評價。方法 采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和GICA，同時對104例可疑類風濕性關節炎（RA）患者進行抗-CCP抗體檢測，計算兩種方法檢測結果的陰性符合率、陽性符合率、總符合率以及Kappa值。用±20%臨界值濃度標本各重復檢測20次，記錄陰性和陽性結果數，驗證GICA法重復性。結果 兩種方法檢測結果比較，陰性符合率、陽性符合率、總符合率、Kappa值分別為92%、100%、96%、0.92。GICA法檢測+20%臨界值濃度標本結果陽性數為20次 ，陽性率100%；-20%臨界值濃度標本結果陰性數為15次，陰性率為75%。結論 GICA法與ELISA法檢測抗-CCP抗體結果一致性良好，而且GICA方法簡單、快速，敏感性和特異性較高，是早期篩查類風濕性關節炎值得推廣的方法。

[關鍵詞] 抗環瓜氨酸肽抗體 ；膠體金免疫層析法 ；性能評價

[中圖分類號] R593.22 [文獻標識碼] B [文章編號]1673-9701（2011） 32-84-02

Performance Evaluation of Colloidal Gold Test for the Detection of Anti-cyclic Citrullinated Peptide Antibody

MU Yinyu WU Qiaoping WU Ludan

Department of Clinical Laboratory，Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital in Zhejiang Province，Ningbo 315040，China

[Abstract] Objective To verify and evaluate the performance of the anti-cyclic citrullinated peptide antibody（CCP） by the rapid colloidal gold immunochromatographic strip．Methods All 104 serum samples were detected parallelly by ELISA and GICA，calculating the negative rate，the positive rate，the total rate and Kappa value．The samples of ±20% concentration of cutoff were detected 20 times repeatedly，recording the positive and negative number．Results The negative rate，the positive rate，the total rate and Kappa value of the two test were 92%，100%，96% and 0.92．The positive rate of +20% concentration of cutoff was 100% ，and the negative rate of -20% concentration of cutoff was 75%. Conclusion The consistency of the ELISA and GICA for the anti-cyclic citrullinated peptide antibody is good．GICA kit is simple and easy to operate，relatively high sensitivity and specificity．It is a useful assay in the clinical early screening inspecting of RA．

[Key words] Anti-cyclic citrullinated peptide antibody；Colloidal gold immunochromatography；Performance evaluation

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性關節病，病因和病理機制還不是很明確。其特征性癥狀為對稱、多個周圍性關節的慢性炎癥病變，臨床表現為受累關節疼痛、腫脹、功能下降，病變呈持續、反復發作的過程，很多患者兩年內出現不可逆骨破壞。RA可發生于任何年齡和性別，但多數在40～60 歲發病，嚴重威脅人類特別是老年人的健康；我國的發病率為0.32%～0. 36%[1]。目前對于RA 的診斷采用2009年第73屆美國風濕病學年會（ACR/ARPH）公布的最新的RA診斷標準，新標準將抗-CCP抗體檢測納入其中。在臨床應用中，抗-CCP抗體逐步發展成為早期診斷RA的首選檢測指標。近10年世界各國檢測抗-CCP抗體多采用ELISA法，由于該方法繁瑣，操作復雜，并未在國內醫療機構普遍使用。隨著實驗技術的改進和發展，2010年5月上海富莼科芯公司首家研制出抗-CCP抗體膠體金免疫層析法試劑盒，使RA的早期篩查的普及成為可能。本文通過與ELISA方法對比，對該公司的該試劑盒檢測抗-CCP抗體的性能進行了驗證和評價，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

根據2009年第73屆美國風濕病學年會（ACR/ARPH）公布的最新的RA診斷標準，收集2010年10~12月間寧波李惠利醫院門診和住院可疑RA患者104例，其中男23例，女81例，年齡22～82歲，平均年齡52歲；其中抗-CCP抗體陽性和陰性標本各52例。

1.2 試劑與儀器

ELISA法試劑盒由德國歐蒙公司生產，GICA試劑盒由上海富莼科芯生物技術股份有限公司生產。美國伯樂（BIO-RAD）680酶標儀。

1.3 方法

1.3.1 膠體金免疫層析技術檢測抗-CCP原理 以硝酸纖維膜作為固相載體，分別在檢測區和質控區劃線包被CCP抗原和質控物。測試時，樣本滴入加樣孔后，血清中的IgG與包被在聚酯膜上的膠體金標記的抗體結合，結合物隨之在毛細效應下橫向層析。當血清中含有特異性抗-CCP抗體時，泳動到檢測區時被CCP抗原捕獲，出現陽性條帶，游離標記物繼續向前移動與結合標記物自動分離，泳動至質控區被捕獲形成陽性質控線。若樣本中不含抗-CCP抗體，則檢測線處不發生特異性結合反應，膠體金標記物繼續層析向前與包被于質控線處質控抗體結合而形成陽性條帶，多余的膠體金標記物繼續層析到吸水墊上。

1.3.2 方法學比較 （1） 將104份標本隨機分成13組，每組8份，保存于-20℃，每天取出一組，測定前充分復融。室溫下嚴格按照說明書操作。（2）根據定性試驗評價方案[2]，每天用兩種方法平行測定一組，連續13d。將所有檢測結果匯總，以ELISA方法為參考方法，進行Kappa檢驗，評價一致性。同時計算兩種方法陽性和陰性符合率以及總符合率。

1.3.3 重復性試驗 高值：在臨界值（25RU/L）基礎上準備+20％濃度（30RU/L）的樣本。低值：在臨界值基礎上準備-20％濃度（20RU/L）的樣本。經ELISA方法檢測后，收集混合而成。將高值和低值各分裝20份，保存于-20℃。室溫下嚴格按照說明書操作。每天取出高值和低值各1份，連續檢測20d，記錄陰性及陽性結果數。

1.4 性能驗證標準

1.4.1 兩種方法一致性驗證標準 Kappa值＞0.75表示具有優秀的一致性；Kappa值0.4～0.75，認為相當好的一致性；Kappa值＜0.4，一致性很差。

1.4.2 陽性、 陰性符合率驗證標準 若檢測結果和參考方法結果相比較一致，則視為驗證的方法陽性、陰性符合率性能符合要求。

1.4.3 臨界值±20%重復性驗證標準 當實驗結果表明+20%濃度的樣本產生陽性結果數≥95%，同時-20%濃度的樣本產生陰性結果數≥95%，說明用該方法檢測臨界值+20%的樣本檢測結果一致。

1.5 統計學處理

用SPSS11.5軟件進行統計學分析，統計兩種方法檢測抗-CCP抗體陰性符合率、陽性符合率、總符合率；兩種方法一致性比較采用Kappa檢驗。

2 結果

2.1 兩種方法一致性

兩種方法檢測104 例血清抗-CCP抗體結果：ELISA法檢出52例陽性，52例陰性；金標法檢出陽性56例，陰性48例。可算出兩種方法檢測抗-CCP抗體，陰性符合率為92%，陽性符合率為100%，總符合率為96%。Kappa值等于0.92。見表1。

2.2 GICA法重復性

由表2可見，用GICA法重復檢測20次高值，20次陽性，陽性率100%；重復20次檢測低值，陽性5次，陰性15次，陰性率75%。

3 討論

目前臨床上檢測抗-CCP抗體多采用ELISA法，特異性和敏感度都比較高，但檢測時間長，操作過程繁瑣，不適合常規操作。而GICA法具有簡單、快速、準確和無污染等優點[3]，可單份測定，特別適合標本量少、人手緊張、設備有限的中小醫院廣泛開展與使用，便于臨床推廣。

本研究以ELISA法作為參考方法，與GICA法進行比較，研究結果顯示兩種方法檢測總符合率為96%，Kappa值為0.92，兩方法一致性良好。此外，GICA檢測52例陰性標本，有4例弱陽性，說明GICA敏感性比較高，可能有假陽性產生，尤其是弱陽性的標本。所以臨床應用過程中，要結合臨床癥狀，排除假陽性現象。

GICA重復性試驗顯示，+20%臨界值濃度標本，重復性為100%，說明用該方法檢測，+20%臨界值濃度標本的檢測結果一致。而-20%臨界值濃度標本，重復性只有75%，不是很理想，說明-20%臨界值濃度的樣本，用該方法檢測，卻不一定能得到一致結果。這也是定性試驗的缺陷，臨界值附近的濃度標本，可出現陰性或陽性的結果。

類風濕性關節炎2009年新診斷標準，將抗-CCP抗體納入其中，為RA早期診斷提供了金標準，臨床上運用也越來越廣泛。大量研究己證實了抗-CCP抗體對RA具有高特異性，有助于與其他風濕性疾病相區別[4~6]。抗-CCP抗體不但能及早提示RA的發病，且對已明確診斷的RA患者，和其他自身免疫性疾病患者，檢測抗-CCP抗體也是有臨床意義的[7]，它的陽性可能提示患者易發生或已發生骨侵蝕破壞，治療時，應注重聯合治療，且預后往往較差。因此常規體檢，尤其是中老年人的體檢可以在原有血清學檢測中加入抗CCP抗體檢測，以達到早篩查、早診斷、早預防、早治療、改善預后。

總而言之，膠體金免疫層析法檢測抗-CCP抗體，性能可靠，操作簡便、快速，完全能夠滿足對RA的初步篩查，值得在臨床推廣使用。

[參考文獻]

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[7] 湯衛菊. 抗環狀瓜氨酸肽（CCP）抗體檢測的臨床應用[J].中國醫藥導報 ，2007，8（11）： 103.

（收稿日期：2011-08-23）