巨細胞病毒DNA檢測在篩查巨細胞病毒感染中的應用

作者單位：537100 廣西貴港市婦幼保健院

通訊作者：鐘偉明

【摘要】 目的 探討熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）方法檢測嬰兒尿液人巨細胞病毒（CMV）DNA在兒科CMV感染診斷中的價值。方法 對565例臨床疑診CMV感染患兒分別應用熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）、酶聯免疫法（ELISA）檢測尿液CMV-DNA及血清CMV-IgM抗體。結果 FQ-PCR檢測尿CMV-DNA的陽性率為42.83%，ELISA檢測嬰兒血清CMV-IgM抗體陽性率為20.18%。兩種方法對CMV感染診斷符合率為76.46%，前者診斷陽性率顯著高于后者（χ²33.59，P<0.01）。結論 FQ-PCR檢測尿液CMV-DNA是早期診斷嬰兒CMV感染的敏感有效的方法。

【關鍵詞】 熒光定量聚合酶鏈反應； 酶聯免疫法； 巨細胞病毒

巨細胞病毒感染是由人巨細胞病毒（CMV）引起的病毒感染性疾病，可累及多臟器、多系統，臨床癥狀多樣且輕重不一。嬰兒感染可導致黃疸、肝脾腫大、皮膚出血點及淤斑等，重癥病死率高，并可導致運動、聽力、視力及智力等多種嚴重的后遺癥^［1，2］，因而受到兒科醫生的極大關注。由于CMV感染臨床表現的非特異性，所以敏感和可依賴的實驗診斷指標顯得非常重要。目前常用的實驗室診斷方法有病毒分離、ELISA檢測CMV特異性抗體、抗原血癥pp65的檢測及DNA的定量檢測。不同的方法各有優缺點。本研究采用熒光定量PCR方法檢測嬰兒尿液CMV DNA，并與血清抗體檢測進行比較，旨在探討尿液CMV DNA定量檢測的診斷意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年7月～2010年10月在本院兒科住院的臨床疑似CMV感染^［3］的患兒565例。年齡14天～2歲。

1.2 標本收集 采集所有被檢驗者靜脈血2 ml，3000 r/min，離心5 min分離血清，置4 ℃冰箱保存，24 h內進行CMV-IgM檢測。同時，留取所有被檢驗者尿液5～10 ml，-20 ℃冰箱保存，24 h內進行CMV DNA檢測。

1.3 試劑及實驗設備 熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測：采用中山醫科大學達安基因診斷公司CMV DNA熒光定量試劑盒。包括DNA提取液，單人單管反應液，CMV標準陽性模板，陰性對照。實時熒光定量PCR擴增儀（DA7600）：中山大學達安基因股份公司生產。CMV IgM抗體檢測：采用美國Hope公司ELISA試劑盒進行常規血清CMV IgM抗體檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 11.5統計軟件對數據進行處理，計數資料比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 疑診CMV感染565患兒尿液中CMV DNA定量檢測陽性242例，陽性率為42.83%。565例患兒血清中CMV IgM抗體檢測陽性114例，陽性率為20.18%。兩種檢測均陽性108例，均陰性317例，二者對CMV感染診斷的一致率為76.46%。FQ-PCR方法檢測尿液CMV DNA陽性率顯著高于ELISA方法檢測血清CMV IgM陽性率，兩者比較，差異有統計學意義（χ²33.59，P<0.01）。

2.2 感染年齡分布 疑診CMV感染565患兒中尿液CMV DNA定量或血清中CMV IgM抗體檢測陽性共248例，其中14～30天8例，1～3個月182例，4～12個月49例，1～2歲9例。

3 討論

兒童巨細胞病毒感染多發生于嬰幼兒期，巨細胞病毒感染是我國兒科嬰兒期最為常見的一種肝臟疾病。表現為黃疸型、非黃疸型肝炎，輕中度肝脾腫大，常有不同程度淤膽^［4］；嚴重的宮內感染可影響中樞神經系統導致發育畸形及生長落后。CMV感染引起的疾病缺乏特異臨床表現，診斷困難。實驗室檢查是診斷巨細胞病毒感染的重要手段。病毒分離作為“金標準”顯然是不實用，無法廣泛推廣的。目前我國主要是以間接酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清CMV IgM抗體作為實驗室診斷指標。IgM陽性提示近期有CMV活動性感染或潛伏的病毒可能被激活。但是CMV抗體產生有一段“窗口期”，由于IgM抗體產生本身有滯后性，當患者被病原體感染后約2周后IgM抗體才能達到被檢測到的水平。另一方面，有些患者，尤其是部分嬰幼兒，免疫系統發育不完善，不能產生被測量的特異性IgM抗體或滯后產生IgM抗體，易造成假陰性結果。CMV IgM抗體檢測陽性114例中，其中108例尿液CMV DNA檢測陽性，說明FQ-PCR檢測對于CMV活動性感染診斷有很好的敏感性。本文248例病例中有190例為30 d內感染，占76.61%，與文獻報道嬰幼兒期高發相符^［5］。

FQ-PCR是目前準確和快速的微生物定量方法^［6］，能早期、靈敏檢測到病毒感染，甚至比出現臨床癥狀的時間提前3～10 d^［7］。且可以進行抗病毒治療效果監測^［8］。由于尿液標本取材方便、無創，易為家長和小兒接受。本研究中，FQ-PCR方法檢測尿液CMV DNA陽性率顯著高于ELISA方法檢測血清CMV IgM陽性率，兩種方法比較有顯著性差異（χ²33.59，P<0.01），說明了尿CMV DNA定量檢測方法的敏感性高于血清CMV IgM抗體檢測法。尿FQ-PCR檢測CMV DNA可以提高小兒CMV感染的檢出率。與定性PCR方法相比，實時熒光定量PCR采用完全閉管檢測，無PCR后處理，避免了交叉污染，通過探針雜交進一步提高了特異性；檢測信號實時檢測產物，定量結果準確，重復性好，可用于體內CMV的動態監測。實時熒光定量PCR法測定尿CMV DNA 含量可用于臨床早期快速診斷小兒CMV感染，對于指導臨床治療、評價觀察抗病毒治療的效果具有重要意義。

參 考 文 獻

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［3］ 中華醫學會兒科分會感染消化學組.巨細胞病毒感染診斷方案.中華兒科雜志，1999，37（3）:441.

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［7］ R isatti GR，Callahan JD，Nelson WM，et al.Rapid detection of classical swine fever virus by a portable Real-Time reverse Transcriptase PCR assay.J Clin Microbiol，2003，41（1）:500-505.

［8］ 徐錦，陳劍平，丁韻珍，等.尿巨細胞病毒定量檢測在巨細胞病毒感染診斷中的意義.實用兒科臨床雜志，2006，21（10）:596-597.

（收稿日期：2011-03-18）

（本文編輯：梅宏偉）