抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠的制備與鑒定

[摘要] 目的 制備抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠去除紅細胞懸液和機采血小板中的sHLA-Ⅰ分子。方法 將單克隆抗體W6/32以共價偶聯的方式包被制備免疫磁珠，以FITC標記的羊抗鼠二抗標記磁珠，用流式細胞儀鑒定包被效果。取10例紅細胞懸液和機采血小板上清和制備好的免疫磁珠孵育后移去磁珠，用ELISA檢測吸附前后sHLA-Ⅰ濃度變化評價吸附效果。結果 制備的抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠包被效率約為75%。對紅細胞懸液和機采血小板中sHLA-Ⅰ的吸附效果可達到84%和83%。 結論 采用單克隆抗體W6/32制備的免疫磁珠能有效去除紅細胞懸液和機采血小板中的sHLA-Ⅰ分子，在改善臨床輸血安全方面有廣闊的應用前景。

[關鍵詞]可溶性組織相容性抗原Ⅰ類分子；免疫磁珠

[中圖分類號] R392.33 [文獻標識碼]B[文章編號] 1673-9701（2011）19-149-02

The Preparation and Appreciation of Anti-sHLA-I Immune Magnetic Bead

YAN Shaorong1 LI Qiang1 YU Shifang2

1. Department of Clinical Laboratory，Ruian City People’s Hospital，Ruian 325200，China；2.Blood Bank，First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To prepare anti-soluble human leukocyte antigens I （sHLA-I） immune magnetic bead for adsorbing and removing the soluble HLA –I of red cell suspension and machine adopting platelet. MethodsThe magnetic beads are coated with monoclonal antibody W6/32 by covalence coupling’s way. Then the magnetic beads are marked by the sheep-anti-mouse second antibody marked by FITC and are appraised the coating effect by flow cytometer（FCM）. Ten example red cell suspension and machine adopting platelet supernatant are selected and incubated with the prepared immune magnetic bead. Then the beads are removed from the mixed liquor and the density of the sHLA-I in the supernatant is detected by ELISA to compare the density change before and after adsorbing and appreciate the adsorbing effects. Results The prepared anti-sHLA-I magnetic beads’coating efficiency is 75%.The adsorbing effect to soluble HLA-I existing in red cell suspension and machine adopting platelet respectively is 84% and 83%. Conclusion The magnetic beads prepared with monoclonal antibody W6/32 can adsorb and remove efficiently the soluble HLA-I existing in red cell suspension and machine adopting platelet，which will have extensively appliedperspective in improving clinical transfusing blood safe.

[Key words] Soluble human leukocyte antigens I （HLA-I）； Immune magnetic bead

儲存血上清中含有高濃度的可溶性組織相容性抗原Ⅰ類分子sHLA-Ⅰ，研究表明可溶性組織相容性抗原Ⅰ類分子sHLA-Ⅰ與受血者免疫功能抑制（Transfusion-related immunomodμLation，TRIM）的發生密切相關[1]，常規的白細胞過濾技術無法有效地去除儲存血中的sHLA-Ⅰ，筆者嘗試采用制備抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠以特異性地吸附去除儲存血中的sHLA-Ⅰ分子，現報道如下。

1材料與方法

1.1試劑

抗HLA單克隆抗體W6/32（貨號：ab23755，abcam公司），免疫磁珠（貨號：PM3-008，上海奧潤納新材料有限公司），FITC標記的羊抗鼠二抗（solarbio），1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亞胺（EDC，SIGMA），N-羥基丁二酰亞胺（NHS，SIGMA），嗎啉-乙磺酸（MES，SIGMA），Human HLA-1 ELISA Kit（美國RD Systems Inc）。

1.2儀器

奧磁多功能磁分離器（貨號：MS-12，上海奧潤納新材料有限公司），流式細胞儀（Cytomics FC500 MPL，Beckman CoulterInc），低溫離心機（Scientific Sorvall Legend Micro 17R，thermo），恒溫振蕩培養箱（HZQ-X100，太倉市實驗設備廠）。

1.3 儲存血標本

隨機選取溫州市中心血站提供的貯存紅細胞（RBC，10例）和機采血小板（PLT，10例）。

1.4方法

1.4.1EDC和NHS活化磁珠 取2mgPM3-008磁珠到1.5mL離心管中，用500μLMEST（10Mm MES，pH6.0，0.05%TWEEN 20）洗滌兩次，磁分離后移除上清；加入200μL新配制的EDC（5mg/mL）和200μLNHS（5mg/mL）溶液到裝有PM3-008磁珠的離心管中，渦旋混勻使磁珠充分懸浮，置于恒溫振蕩培養箱中37℃活化30min，進行混勻；離心管置于磁分離架上進行磁分離，移除上清，加入500μL BST（5mm boric acid，0.05% tween 20，ph9.0），將磁珠轉移到新的離心管中；離心管置于磁分離架上進行磁分離，移除上清，磁珠用500μL BST 洗滌兩次，磁分離，移除上清；經過上述步驟之后，PM3-008磁珠表面的羧基已經活化，可以與帶有伯胺基的生物配體進行共價偶聯。

1.4.2 抗HLA單克隆抗體W6/32的共價偶聯 加入20μg生物配體到上述離心管中，用BST溶液調節總體積至500μL，輕柔混勻磁珠和生物配體；37℃偶聯至少3h，該期間保持磁珠的懸浮狀態；離心管置于磁分離架上進行磁分離，移除上清，加入1mL BST（含1% BSA）重懸磁珠，置于恒溫振蕩培養箱中37℃活化30min，進行混勻；離心管置于磁分離架上分離磁珠，移除上清，磁珠用500μL BST洗滌4次；磁分離，移除上清，磁珠用1mL BST（含0.02%NaN3，0.5%BSA）重懸，保存于4℃。

1.4.3 流式細胞儀鑒定免疫磁珠包被效果取100μL偶聯好的免疫磁珠，以FITC標記的羊抗鼠二抗進行標記，置于恒溫振蕩培養箱中37℃孵育30min，離心管置于磁分離架上進行磁分離，PBS洗滌2次，以500μL PBS重懸，流式細胞儀鑒定免疫磁珠包被效果。

1.4.4 免疫磁珠吸附去除效果評價儲存血樣本12000r/min離心5min，留取一部分血漿采用ELISA檢測去吸附前sHLA-Ⅰ含量。再取500μL的血漿，加入50μL制備的偶聯好的免疫磁珠，置于恒溫振蕩培養箱中37℃孵育30min，離心管置于磁分離架上進行磁分離，ELISA檢測吸附后sHLA-Ⅰ濃度，操作過程按試劑盒說明進行。

1.5 統計學分析

樣本均數采用（χ±s）表示，樣本間比較采用t檢驗，統計分析采用SPSS13.0軟件處理。

2結果

2.1#8195;免疫磁珠偶聯效果

見圖1。圖1結果顯示采用上述方法制備的抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠的抗體包被效率約為75%。

2.2#8195;免疫磁珠吸附效果評價

ELISA檢測吸附前后儲存血血漿中sHLA-Ⅰ濃度比較見表1。表1顯示，貯存紅細胞RBC和機采血小板PLT經免疫磁珠吸附前后血漿部分中sHLA-I含量比較有顯著性差異（P＜0.05）。

3討論

同種異體輸血造成受血者免疫功能抑制[2]，導致腫瘤復發率和術后感染率增高的機制目前尚不清楚，但大量的研究表明供血者的白細胞在其中起著相當關鍵的作用。臨床研究發現，輸注用濾網去除白細胞的同種異體血液可以顯著降低受血者的死亡率，減少輸血后發熱和抗生素的應用，并且同自體輸血所造成的術后感染率和腫瘤復發率無統計學差異[3]。另一些學者[4]研究表明單純輸注去除白膜的紅細胞的患者術后感染率與輸注全血的患者術后感染率無統計學差異，提示血液中的其他成分中也可引起受血者免疫功能抑制。

Gluo[5]研究發現儲存30d的紅細胞懸液和隨機采集的血小板中的可溶性HLA-1 （sHLA-I）類分子濃度顯著高于其他血液成分中的sHLA-Ⅰ分子濃度。sHLA-Ⅰ類分子可以與CD8＋CTL細胞膜表面的TCR結合，阻礙了TCR特異性識別靶細胞膜上的sHLA-Ⅰ類分子——抗原復合物，從而阻礙了CTL的活化；sHLA-Ⅰ類分子還可能阻礙活化的CTL與靶細胞結合發揮效應[6-7]。

臨床輸注血液中sHLA-Ⅰ分子主要是儲存過程中從白細胞表面脫落下來的，成分輸血中血小板上清中的sHLA-Ⅰ則是由血小板降解所產生的。考慮到當前的血液制品減白技術并不能完全去除白細胞，目前我國采用的儲存后（dockable filtration）減白法無法減少sHLA-Ⅰ分子等可溶性分子的產生，即使在儲存前（in-line或dockable filtration）減白因為血液制品中血小板的降解也無法避免sHLA-Ⅰ分子的產生；因此如何去除血液制品中sHLA-Ⅰ分子就成為當前輸血后免疫抑制研究中所面臨的關鍵問題。本研究采用抗HLA單克隆抗體W6/32制備的免疫磁珠能夠有效地吸附去除紅細胞懸液和機采血小板中的可溶性HLA分子，在改善臨床輸血安全方面有著廣闊的應用前景。

[參考文獻]

[1] Ghio M，Contini P，Mazzei C，et al. Soluble HLA class I and Fas ligand molecμLes in blood components and their role in the immunomodμLatory effects of blood transfusions[J]. Leuk Lymphoma，2000，39（1-2）：29-36.

[2] Hebert PC，Fergusson D，Blajchman MA，et al. Clinical outcome following institution of the Canadian universal leukoreduction program for red blood cell transfusions[J]. JAMA，2003，289（15）：1993-1995.

[3] Chelemer SB，Prato BS，Cox PM Jr，et al. Association of bacterial infection and red blood cell transfusion after coronary artery bypass surgery[J]. Ann Thorac Surg，2002，73：138-142.

[4] Mynster T，Nielsen HJ，Danish，et al. Storage time of transfused blood and disease recurrence after colorectal cancer surgery[J]. Dis Colon Rectum，2001，44：955-964.

[5] Ghio P， ContiniC，MazzeS，et al. Soluble HLA class I，HLA class II， and Fas ligand in blood components： A possible key to explain the Immunomodμlatory effects of allogeneic blood transfusions[J]. Blood，1999，93（5）：1770-1777.

[6] Ottonello L，Ghio M，Contini P，et al. Nonleukoreduced red blood cell transfusion induces a sustained inhibition of neutrophil chemotaxis by stimuLating in vivo production of transforming growth factor-beta1 by neutrophils：role of the immunoglobuLinlike transcript 1，sFasL，and sHLA-I[J]. Transfusion，2007，47（8）：1395-1404.

[7] NovikovVV，Egorova NI，Kurnikov GY，et al.Serum levels of soluble HLA and IL-2R molecuLes in patients with urogenital chlamydia infection[J]. Adv Exp Med Biol， 2007，601：285-289.

（收稿日期：2011-05-31）

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