血管緊張素抑制劑對糖尿病心臟損傷的保護(hù)機(jī)制

[摘要] 目的 本課題旨在研究2型糖尿病大鼠心臟血管緊張素II的變化及其影響，并探討其機(jī)制。方法將雄性SD （Sprague Dawley）大鼠分為兩組，糖尿病組高糖高脂喂養(yǎng)，用小劑量（40mg/kg）鏈唑霉素腹腔注射誘導(dǎo)成為2型糖尿病大鼠模型；對照組普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射檸檬酸緩沖液；再將糖尿病組分為兩組，一組灌胃生理鹽水（0.5mL/（kg·d），一組灌胃雷米普利水溶液（1mg/（kg·d），灌胃8周后，檢測心功能的各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)，測定血漿與心肌組織中血管緊張素II（AngⅡ）的含量，測定心肌Caspase-3活性，測定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）含量，測定心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。結(jié)果同對照組比較，2型糖尿病組血漿與心肌組織中的AngII含量明顯升高，心功能LVSP、dp/dtmax明顯下降、LVEDP明顯升高，Caspase-3、CK-MB 、cTnI、MDA均明顯升高，SOD明顯降低；與灌胃生理鹽水組相比，灌胃雷米普利組血漿與組織中AngII含量明顯降低，心功能dp/dtmax明顯升高、LVEDP明顯降低，Caspase-3、CK-MB 、cTnI、MDA均明顯降低，SOD明顯升高。結(jié)論 血管緊張素II升高參與了糖尿病時髙糖高脂所介導(dǎo)的心臟功能受損、心肌細(xì)胞損傷，因此通過對AngII的抑制，可以對2型糖尿病引起的心臟損傷起到一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 2型糖尿病；血管緊張素II；心臟

[中圖分類號]R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）19-12-04

Protection Mechanism of Angiotensin Inhibitors on Cardiac Injury in Rats with Diabetes

ZHANG ZhongYANG YanhongJIAO Xiangying

Anatomic Department， Cytophysiology Key Laboratory ofShanxi Medical University of Common Foundation by Shanxi Province and Ministry of Education ， Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To studytheprotection mechanism of angiotensin inhibitors on cardiac injury in rats withtype 2 diabetes. Methods Male Sprague Dawley (SD) rats were divided into two groups， high-sugar high-fat fed diabetic group， with a small dose (40 mg / kg） intraperitoneal injection of streptozotocin induced rat model of type 2 diabetes to become; control group of ordinary diet， intraperitoneal injection of citrate buffer; Diabetic group and then divided into two groups， one group was given normal saline （0.5mL/（kg· d）)， one group was given ramipril solution(1mg/(kg· d）)， eight weeks after gavage， test heart function The parameters and measured plasma and cardiac tissue angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ) content of myocardial Caspase-3 activity， serum creatine kinase（CK-MB）， cardiac troponin Ⅰ （cTnI ) Content of myocardial superoxide dismutase (SOD)， malondialdehyde (MDA) content. Results The Results showed that compared with the control group， type 2 diabetes， plasma and myocardium Ang Ⅱ was significantly higher in heart function LVSP， dp/dtmax decreased， LVEDP increased significantly， Caspase-3， CK-MB， cTn1， MDA were significantly increased， SOD significantly decreased; and intragastric saline group， fed the blood ramipril award and tissue Ang Ⅱ were significantly decreased heart function dp/dtmax increased significantly， LVEDP decreased， Caspase -3， CK-MB， cTn1， MDA were significantly decreased， SOD significantly increased. ConclusionAngiotensin Ⅱ increased in the diabetes high glucose and lipid-mediated impaired heart function， myocardial cell damage， through inhibition of Ang Ⅱ may be due to type 2 diabetes， heart damage play a protective role.

[Key words] Type 2 diabetes;Angiotensin Ⅱ; Heart

糖尿病是由于胰島素絕對或相對不足所引起的一種以糖脂代謝紊亂為主要表現(xiàn)并波及多個器官的慢性代謝疾病。近年來，糖尿病的發(fā)病率、死亡率明顯上升，長期的糖脂代謝異常可引起多個器官發(fā)生病變，其中以心臟并發(fā)癥最為多見，是糖尿病患者死亡的主要原因，可達(dá)55%[1]，糖尿病已繼高血壓之后成為威脅我國公共衛(wèi)生健康的重要問題之一。

近年來有研究表明，在糖尿病患者體內(nèi)全身和局部的血管緊張素Ⅱ升高，抑制其生成可以減少糖尿病的發(fā)生率及糖尿患者心血管疾病的死亡率，但其確切作用和機(jī)制不明[2，3]。本課題嘗試采用臨床上廣泛使用的、成熟的治療高血壓藥物血管緊張素Ⅱ的抑制劑來治療糖尿病心肌細(xì)胞損傷，并從各方面對其作用機(jī)制進(jìn)行研究探討，為臨床探索糖尿病的治療用藥提供理論依據(jù)，為降低糖尿病的罹患率和死亡率、保護(hù)人們的生命健康，促進(jìn)整個社會的和諧健康發(fā)展提供幫助。

1材料與方法

1.1#8195;試劑和儀器

大鼠胰島素（Insulin）、血管緊張素Ⅱ (angiotensinⅡ，AngⅡ)、血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB， CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I (cardiac troponin I， cTnI)ELISA試劑盒均購自美國ADL 公司；超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase SOD）、丙二醛（Maleic Dialdehyde MDA）、考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒均購自南京建成公司；雷米普利（Ramipril Tablers）（5mg/片）購自昆山龍燈瑞迪制藥有限公司；血糖儀采用美國強(qiáng)生OneTouch血糖儀；AFC標(biāo)準(zhǔn)品、Ac-DEVD-AFC熒光底物均購自BIOMOL 公司；Emax酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司]。

1.2#8195;動物與分組

雄性Sprague Dawley (SD)大鼠40 只(由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體重160～180 g，隨機(jī)分為兩大組：糖尿病組30只、對照組10只。其中糖尿病組經(jīng)(普通飼料中加入10%豬油、10%蛋黃粉、20% 蔗糖)喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素 (streptozocin， STZ，40 mg/kg，溶于檸檬酸緩沖液，pH 4.5)造模，造模成功后繼續(xù)用高糖高脂飼料喂養(yǎng)；對照組經(jīng)普通飼料喂養(yǎng)4 周后，給予腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。注射STZ后1周經(jīng)尾靜脈采血測空腹血糖濃度(fasting blood glucose， FBG)，F(xiàn)BG≥16.7mmol/L者確定為糖尿病大鼠造模成功[4]。造模完成后將糖尿病組分成兩組，灌胃生理鹽水組[0.5mL/(kg·d）]15只、雷米普利水溶液(1mg雷米普利溶于5 mL生理鹽水中)組[1mg/(kg. d)]15只，灌胃8周后觀察大鼠的心功能、Ang Ⅱ等指標(biāo)。

1.3#8195;大鼠血糖濃度、血清胰島素的測定

分別于造模前和注射STZ后1周及灌胃8周后進(jìn)行大鼠斷尾采血(采血前大鼠禁食12 h)，測定血糖濃度；同時取血靜置后，3000 r/min離心10 min制備血清，按大鼠胰島素ELISA試劑盒說明測定各時間點(diǎn)大鼠血清胰島素含量。

1.4#8195;大鼠心功能測定

大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯（1g/kg）麻醉，頸部切口后，經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管至左心室，導(dǎo)管的另一端連接P50壓力換能器，壓力信號輸入MS2000生物信號記錄分析系統(tǒng)。導(dǎo)管插入左心室后穩(wěn)定15～20min記錄心功能各項(xiàng)參數(shù)：心率（HR）、左心室收縮壓（leftventricularsystolicpressure，LVSP）、左心室內(nèi)壓上升最大速率（dp/dtmax）及左心室舒張末期壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）。

1.5#8195;AngⅡ、CK-MB、cTnI含量測定

抽取大鼠外周靜脈血(肝素抗凝)0.5 mL，靜置分層后，3000r/min離心10min，吸取上清制備血清；取心肌組織，按1mg組織加入10μL雙蒸水，至冰上剪碎，勻漿，離心制備組織勻漿。分別按相關(guān)ELISA試劑盒說明測定血清AngⅡ、CK-MB、cTnI 含量及組織AngⅡ的含量。

1.6#8195;心肌caspase-3活性測定

Caspase-3的活化是細(xì)胞凋亡的最終共有途徑，其活性可以反映凋亡發(fā)生的程度。活性測定基本步驟如下[5]：取心肌組織，按1mg組織加入10μL 裂解液的比例進(jìn)行裂解，置冰上剪碎，勻漿，離心。上清用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定蛋白濃度。取上清、反應(yīng)緩沖液，底物(Ac-DEVD-AFC)加至ELISA板中水浴后，用酶標(biāo)儀405nm下測定光密度值，同時ELISA板中加入不同濃度AFC作為標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)后作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品caspase-3活性結(jié)果以每毫克心肌蛋白單位時間分解底物產(chǎn)生AFC的速度來表示。

1.7#8195;心肌組織MDA、SOD含量測定

取心肌組織，按1mg組織加入10μL雙蒸水，至冰上剪碎，勻漿，離心取上清，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定蛋白濃度，并分別按相關(guān)試劑盒說明測定MDA、SOD含量。

1.8#8195;統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（χ±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，樣本均數(shù)組間比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05 時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2#8195;結(jié)果

2.1#8195;血糖濃度、血清胰島素水平變化

飼養(yǎng)前及飼養(yǎng)4周時各組間FBG均無明顯差異；注射STZ 1周后，糖尿病組FBG均＞16.7mmol/L，且較對照組顯著升高（P＜0.01） ，表明糖尿病造模成功。糖尿病組大鼠血清胰島素與對照組比較也顯著升高（P＜0.01）。見表1。結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)建立的糖尿病大鼠模型具備高血糖、高胰島素血癥等2型糖尿病的主要臨床特征，顯示2型糖尿病模型建模成功。灌胃8周后，糖尿病生理鹽水組、糖尿病雷米普利組FBG較對照組均顯著升高（P＜0.01），糖尿病生理鹽水組胰島素較對照組顯著升高（P＜0.01），糖尿病雷米普利組較對照組與糖尿病生理鹽水組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果提示，經(jīng)過8周的灌胃藥物，糖尿病雷米普利組的胰島素水平雖較糖尿病生理鹽水組無顯著差異，但較對照組也無明顯差異，說明灌胃藥物發(fā)揮了一定作用。

2.2#8195;大鼠血漿與心肌中AngⅡ含量的變化

與對照組相比，糖尿病生理鹽水組血漿、心肌組織中AngⅡ含量均明顯升高（P＜0.01），提示大鼠糖尿病時，血漿與心肌組織中Ang Ⅱ生成明顯增加，Ang Ⅱ含量明顯的升高，推測AngⅡ在糖尿病大鼠心臟損傷中發(fā)揮著很重要的作用；與糖尿病生理鹽水組相比，糖尿病雷米普利組血漿中、組織中Ang Ⅱ含量明顯降低（P＜0.01），見表2。提示，灌胃藥物雷米普利明顯抑制大鼠心肌中AngII含量，抑制Ang Ⅱ的大鼠模型塑造成功。

2.3#8195;大鼠心功能變化

與對照組相比，糖尿病生理鹽水組dp/dtmax顯著下降（P＜0.01）、LVSP明顯下降（P＜0.05)、LVEDP明顯升高（P＜0.01）；提示大鼠糖尿病后，心功能受到影響，心臟能力降低；與糖尿病生理鹽水組相比，糖尿病雷米普利組dp/dtmax明顯升高（P＜0.01)、LVEDP明顯下降（P＜0.01），見表3。提示灌胃藥物后，大鼠心功能有明顯的改善。

2.4#8195;心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)變化

與對照組相比，糖尿病生理鹽水組Caspase-3顯著升高（P＜0.01），提示：糖尿病大鼠心肌細(xì)胞有明顯的凋亡現(xiàn)象發(fā)生；與糖尿病生理鹽水組相比，糖尿病雷米普利組Caspase-3顯著下降（P＜0.01），見表4。提示：糖尿病雷米普利組經(jīng)治療后較糖尿病生理鹽水組細(xì)胞凋亡顯著減少，心肌細(xì)胞損傷明顯減輕。

2.5#8195;大鼠血漿CK-MB 、cTnI變化

與對照組相比，糖尿病生理鹽水組CK-MB、 cTnI均顯著升高，（P＜0.01）提示2型糖尿病時大鼠心肌明顯受到損傷；與糖尿病生理鹽水組相比，糖尿病雷米普利組CK-MB、cTnI均明顯下降（P＜0.01），見表5。結(jié)果提示，經(jīng)過藥物灌胃后糖尿病雷米普利組心肌損傷較糖尿病生理鹽水組明顯減輕，說明對于Ang Ⅱ的抑制明顯減輕了糖尿病時大鼠心肌的損傷。

2.6#8195;大鼠心肌組織SOD、MDA變化

與對照組相比，糖尿病生理鹽水組MDA值顯著升高（P＜0.01）、SOD值顯著下降（P＜0.01），提示糖尿病大鼠心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度加快，細(xì)胞清除氧自由基的能力減弱，心肌細(xì)胞明顯受到損傷；與糖尿病生理鹽水組相比，糖尿病雷米普利組MDA值顯著下降（P＜0.01）、SOD值顯著升高（P ＜0.01），見表6。提示糖尿病雷米普利組經(jīng)過灌胃治療，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度減慢，細(xì)胞清除氧自由基的能力加強(qiáng)，心肌細(xì)胞的損傷明顯減輕，證明通過抑制AngII含量，緩解了大鼠心肌的損傷。

近年來，糖尿病在我國呈現(xiàn)快速上升的趨勢，據(jù)2007～2008年我國開展的糖尿病大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全國糖尿病的患病率已達(dá)9.7%，糖尿病前期的患病率高達(dá)15.5%，我國已成為全球糖尿病患者最多的國家；調(diào)查研究還顯示，2型糖尿病患者發(fā)生心血管疾病和猝死的危險比普通人群高出2～4倍，同時壽命減少5～10年，在所有與糖尿病相關(guān)的死亡中，80%左右與心血管疾病相關(guān)，心血管疾病已成為糖尿病患者最主要的并發(fā)癥和首要致死原因。

來自HOPE[6]的臨床調(diào)查報告發(fā)現(xiàn)，給予雷米普利每日10mg長期口服治療的患者與安慰劑對照組相比，糖尿病新發(fā)比率降低34%；同時也有研究表明，糖尿病患者血中的Ang Ⅱ水平有明顯升高的現(xiàn)象[7]，我們推測血管緊張素II在糖尿病引起的損傷中發(fā)揮了很重要的作用。我們在實(shí)驗(yàn)中觀察到，2型糖尿病大鼠與對照組大鼠相比，血漿與心肌組織中血管緊張素Ⅱ的含量都明顯升高，由此推測糖尿病引起了大鼠血管緊張素系統(tǒng)的變化，血管緊張素Ⅱ的升高參與了糖尿病髙糖高脂介導(dǎo)的心臟功能損傷，在接下來的實(shí)驗(yàn)中便證實(shí)了這一點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，糖尿病組心功能LVSP、dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高，表明糖尿病時，大鼠心臟功能明顯減弱；糖尿病組Caspase-3明顯高于對照組，說明糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，心肌細(xì)胞明顯受到損傷；糖尿病組血漿中CK-MB 、cTnI含量明顯升高，CK-MB、cTnI作為兩種心肌損傷標(biāo)記物，其在糖尿病大鼠血漿中含量的明顯升高，表明糖尿病時，大鼠心肌受到了明顯的損傷；糖尿病組心肌組織中MDA明顯升高、 SOD明顯降低；而通過對血管緊張素Ⅱ抑制后發(fā)現(xiàn)，糖尿病雷米普利組同糖尿病生理鹽水組相比較，心功能有了明顯的改善，心肌細(xì)胞的凋亡明顯地減少，血漿CK-MB、cTnI明顯地升高，心肌組織MDA 明顯地升高、SOD明顯地降低。這些就證實(shí)了糖尿病時引起的血管緊張素Ⅱ含量的升高，通過影響心肌組織中自由基生成增多的途徑，引起了糖尿病時心肌細(xì)胞的損傷，心功能的降低；同時也表明了血管緊張素抑制劑可以使糖尿病患者在血糖基本不變的情況下，減輕心臟的損傷，提高心功能，降低糖尿病引起心血管疾病并發(fā)癥的幾率[8]。

關(guān)于糖尿病時血管緊張素Ⅱ升高的機(jī)制，目前尚不清楚。有研究提示，糖尿病時高糖可引起肺組織血管緊張素轉(zhuǎn)換酶表達(dá)及活性增加[9]，轉(zhuǎn)化生長因子-β表達(dá)增加，心肌糜蛋白酶表達(dá)增加[10]，二者均可分解血管緊張素Ⅰ使得血管緊張素Ⅱ生成增多。

綜上所述，我們在實(shí)驗(yàn)中使用2型糖尿病大鼠模型證明，血管緊張素Ⅱ升高參與了糖尿病時髙糖高脂所介導(dǎo)的心臟功能受損，該損傷與其引起的心肌組織中自由基生成增多有關(guān)，通過對血管緊張素Ⅱ的抑制，明顯減輕了糖尿病引起的心臟功能受損，明顯減少了心肌細(xì)胞凋亡。除自由基的大量生成外，糖尿病時還伴有大量炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1等的生成和損傷，血管緊張素Ⅱ是否參與這條途徑，我們將在下一步的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行觀察。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Geiss LS， Herman WH， Teutsch SM. Diabetes and renalmortality in the United States [J]. Am J Public Health，1985，75（11）：1325-1326.

[2]Toto RD. Heart disease in diabetic patients[J].Semin Nephrol， 2005，25（6）：372-378.

[3] 張國輝. 糖尿病不同治療方法對血漿ET-1和Ang-Ⅱ影響的研究[J].吉林醫(yī)學(xué)，2010，31（15）：2186-2187.

[4] Fang KY， Shi MJ， Xiao Y， et al. p38 MAPK mediates high glucose-induced renal tubular epithelial-mesenchymal transition [J]. Acta Physiol Sin，2008， 60（6）：759-766 .

[5] Zhang H， Tao L， Jiao X，et al. Nitrative thioredoxin inactivation as a cause of enhanced myocardial ischemia/reperfusion injury in the aging heart [J]. Free Radic Biol Med， 2007， 43（1）：39-47.

[6]Bosch J， Lonn E， Pogue J， et al.Long-term effects of ramipril on cardiovascular events and on diabetes: results of the HOPE study extension[J]. Circulation， 2005， 112（9）：1339-1346.

[7]Fiordaliso F， Li B， Latini R， et al.Myocyte death in strep to zo to cin-induced diabetes in rats in angiotens in II- dependen[J]. Lab Invest， 2000， 80：513-527.

[8] 殷憲剛張才擎.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑對心臟的保護(hù)作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，1996，（4）： 4.

[9] Maria E.Pueyo，Mireille Challah，Dominique Gauguier，et al. Transforming growth factor-α1 Production is correlated with genetically determined ACE expression in congenic rats [J]. Diabetes， 2004，53: 1111-1118.

[10] 叢麗，李益明，俞茂華，等.糖尿病倉鼠心肌糜蛋白酶和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因表達(dá)的變化[J].中華糖尿病雜志，2005 ，13 (6 ):459-462.

（收稿日期：2011-03-16）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文