抗原修復技術與卵巢癌腫瘤標志物免疫組化染色結果分析

[摘要] 目的 了解抗原修復對免疫組化染色結果的影響，分析抗原修復后免疫組化染色P53蛋白和CA-125陽性率的關系。方法 卵巢癌標本93例，其中漿液性腺癌47例，黏液性腺癌39例。子宮內膜樣癌5例，未分化癌2例，采用高溫高壓法進行抗原修復，免疫組化Envision法染色檢測P53蛋白和CA-125的表達。結果 抗原修復后切片背景干凈，顯色對比鮮明，結構清晰，定位準確，易于觀察，P53蛋白陽性率（66.7% 比 48.4%）和CA-125陽性率（58.1%比40.0%）均高于未修復組，有顯著性差異（P＜0.05）。結論 抗原修復技術對提高卵巢癌免疫組化染色質量有一定提高。

[關鍵詞] 卵巢癌；免疫組織化學；抗原修復；病理診斷

[中圖分類號]R737.31 [文獻標識碼] B [文章編號]1673-9701（2011）19-93-02

卵巢腫瘤是女性生殖器常見腫瘤，卵巢癌病死率居婦科惡性腫瘤之首。隨著免疫組化技術在腫瘤病理診斷中的不斷深入和廣泛應用， 卵巢腫瘤特異性抗原或者基因的檢測日趨成熟，對卵巢腫瘤的病理分型和預后的判斷越來越有意義[1，2]。但是由于組織定會引起蛋白內和蛋白間的亞甲基橋的橋連，引起許多抗原決定簇被封閉，影響了免疫組化的結果。本研究通過高溫高壓處理法進行抗原修復、免疫組化技術檢測卵巢上皮腫瘤組織中P53蛋白、CA-125，現報道如下。

1資料與方法

1.1 標本來源

卵巢癌標本93例，均來自我院2006年1月～2010年12月住院的卵巢腫瘤患者，年齡18～74歲，平均52.3歲。術前無放療及化療史，經術后病理證實為上皮性卵巢癌。其中漿液性腺癌47例，黏液性腺癌39例。子宮內膜樣癌5例，未分化癌2例。

1.2組織來源

所有組織來源于我院病理科，經術后病理證實為卵巢上皮性惡性腫瘤。標本固定于中性福爾馬林中，4 ℃下24h常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切片。切片厚4μm。每例均切6張，附貼于涂有多聚-L-賴氨酸的玻片上，置60℃烤箱內烘烤。將每個病例的6張切片隨機分為兩組，組1為不修復組，組2為抗原修復組。

1.3抗原修復方法

組1不進行抗原修復，直接進行免疫組化染色；組2采用高溫高壓法進行抗原修復，市售家用壓力鍋，工作壓力為90 kPa。石蠟切片脫蠟至水。PBS浸泡3次，每次2min。將修復液0.01mmol檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）燒開后將切片放入高壓鍋中，然后蓋好蓋子，加上氣壓閥，繼續加熱至噴汽時，即達到工作溫度和工作壓力，開始計時2min后壓力鍋離開熱源，自然冷卻。

1.4免疫組化染色

免疫組化Envision法染色檢測P53蛋白和CA-125的表達。所使用試劑P53蛋白單克隆抗體、CA-125及Envision試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，按其使用說明書操作。用已知P53陽性的鼻咽癌切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。組1石蠟切片脫蠟至水。組2切片自然冷卻后，3%H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗2次，PBS浸泡3次，每次2 min；滴加一抗工作液，37 ℃孵育2 h或4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次2 min；滴加適當量的二抗，37 ℃孵育 0.5 h；PBS沖洗3次，每次2 min；DAB顯色；自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

1.5陽性結果

判斷標準P53蛋白陽性細胞核內有棕色顆粒狀物質、CA-125陽性細胞膜染成棕黃色為陽性。根據陽性細胞所占比例分為4級：0％為陰性（-），1%～10％為弱陽性（+），11%～50％為中等陽性（++），＞50%為強陽性（+++）。

1.6統計學處理

兩組率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

2結果

抗原修復后切片背景干凈，顯色對比鮮明，結構清晰，定位準確，易于觀察；P53蛋白陽性率和CA-125陽性率均高于未修復組，詳見表1。

3 討論

免疫組化是免疫組織化學技術的簡稱，它是應用抗原、抗體特異性結合的原理，使用已知的抗體在病理切片上與相應的抗原結合，然后把結合產物應用組織化學的方法顯現出來，使之可以在顯微鏡下觀察得以確認；是免疫學與分子生物學技術和病理形態結合的一門新興學科，具有操作簡單、敏感性高、特異性強及將形態、代謝和機能密切結合起來等優點，已廣泛用于病理診斷、鑒別診斷[3]。但經10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的切片，組織中的許多抗原決定簇被醛基交聯封閉，以至于無法與抗體結合，從而影響染色結果。并且固定時間越長的標本，它所形成的交聯就越緊密，抗原就越難以被激活，所需的修復強度也就越強。因此組織中抗原性修復技術與免疫組織化學染色的成敗有十分密切的關系[4]。CA-125和P53是常用的卵巢腫瘤標志物，與腫瘤大小、病理類型、分化程度、病人的預后、術后易復發等指標密切相關[5]，因此準確進行免疫組化染色檢查對臨床工作意義重大。本文應用高溫高壓法對93例卵巢癌組織切片分別進行抗原修復，發現修復后切片背景干凈，顯色對比鮮明，結構清晰，定位準確，易于觀察，方法穩定，結果可靠，可提高病理診斷的準確性。

1991年 “甲醛對蛋白的改建可以在高溫120℃及酸堿作用下復原”，這一重要線索成功地創造了抗原修復技術，該技術被譽為“免疫組化染色的一次革命”，迅速在世界范圍內推廣?？乖瓱嵝迯偷脑蚝屠碚摶A是通過加熱水解被醛基交聯封閉的許多抗原決定簇，使抗原決定簇被激活，其中修復的溫度和時間非常重要。高壓鍋進行高溫高壓修復可以避免外界環境改變所致溫度的影響，高壓修復溫度均一，節省時間。高壓抗原修復法在染色強度和重復性等方面優于微波法[6]，是細胞核陽性的抗體。P53蛋白在細胞核表達，本文顯示高溫高壓修復后P53在卵巢癌細胞核的表達水平提高，同時主要在細胞膜表達的CA-125的陽性率也提高了。因此針對卵巢癌P53和CA-125免疫組化染色，高壓鍋修復可以提高陽性表達率，染色清晰，操作簡單，結果易于判斷。

有報道用檸檬酸緩沖液（pH6.0）、EDTA緩沖液（pH9.0）及高壓加熱法，胰蛋白酶消化對CD68、lysozyme、α-AT和S-100不同的抗體進行修復，結果3種抗原修復法的免疫組化切片，胰蛋白酶修復法陽性率顯著高于高壓加熱法與微波加熱法且染色背景清晰，高壓加熱法與微波加熱法非特異性著色較深，陽性率低[7]?？乖迯碗m然可以提高免疫組化陽性率，但是修復的方法較多，包括酶修復、熱修復等，不同組織類型、不同固定方法對抗原的修復應答亦有所差異，因此對不同的抗體建議選用不同的修復方法可提高表達率，提高病理診斷的準確性。

[參考文獻]

[1]章加寶. 超聲與腫瘤標志物檢查早期診斷卵巢癌的比較分析[J].中國醫藥導報，2008，5（34）：75-76.

[2] 趙春生， 裴春紅.化學發光免疫技術檢測腫瘤標志物的影響因素和聯合應用[J].中外醫學研究，2011，9（7）:37.

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[6] 包翠芬， 蘇玉虹， 包翠芳. 熱抗原修復方法的比較[J].錦州醫學院學報，2004，4（25）：29-31.

[7] 陳任生，盛以蕓，熊秋迎，等.免疫組化染色中某些抗體最佳修復方式探討[J].實驗與檢驗醫學，2009，27（2）：118-119.

（收稿日期：2011-02-25）

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