如意金黃散的微生物限度檢查方法探討

[摘要] 目的探討如意金黃散的微生物限度檢查方法。方法按《中國藥典》2010年版微生物限度檢查法進行驗證和試驗。結果 經方法學驗證實驗得出，如意金黃散有抑菌作用，其微生物限度檢查計數方法采用培養基稀釋法（0.5mL/皿，1∶20的供試液），控制菌檢查按培養基稀釋法（銅綠假單孢菌采用100mL BL增菌液；金黃色葡萄球菌采用200mL營養肉湯，1∶20的供試液）進行。結論 經驗證該微生物限度檢查方法適用于如意金黃散的微生物限度檢查。

[關鍵詞] 微生物限度檢查；驗證；如意金黃散

[中圖分類號] R286.0[文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）19-97-02

Study on the Method of Microbial Limit Test for Ruyi Jinhuang San

GAO HongLI KaiZHU Huiqin

Ningxia Institute for Drug Control， Yinchuan 750001， China

[Abstract] Objective To establish the method of microbial limit test for Ruyi Jinhuang San. Methods The validation test was carried out according to Chinese Pharmacopoeia (Chp 2010). Results The results of validation test showed Ruyi Jinhuang San had antibacterial activity. The culture media dilution method was used as the counting methods for the bacteria， moulds and yeasts (0.5mL/dish， 1∶20 sample solution) and the controlled bacteria detection test. Conclusion This method is feasible for the microbial limit test of Ruyi Jinhuang San.

[Key words] Microbial limit test; Validation; Ruyi Jinhuang San

為確保微生物限度檢查方法的可靠性和準確性，《中國藥典》2010年版規定對微生物限度檢查方法需進行驗證。目前，絕大多數藥品的微生物限度檢查方法藥典中都未有具體的檢查方法，都需要進行驗證試驗后建立。如意金黃散具有清熱解毒、消腫止痛的功效，是國家評價性抽驗樣品品種之一。為了比較全面地反映此藥品的整體質量，確保人民用藥安全，另一方面也是為了更好地完成國家評價性抽驗樣品工作，為國家制定政策提供參考依據，本文對如意金黃散的微生物限度具體檢查方法進行了驗證和總結，供同行參考。

1材料與方法

1.1儀器

高壓滅菌器，恒溫恒濕培養箱（32.5℃、25.5℃）。

1.2藥品

如意金黃散七個廠家56個批次（樣品來自全國各地市售及生產廠家）。

1.3培養基

營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基。膽鹽乳糖增菌液（BL增菌液），營養肉湯或亞碲酸鉀肉湯，溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基，pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.4菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。

1.5方法

菌液、供試液制備按中國藥典2010年版二部附錄ⅩⅢ C[1]進行。

按中國藥典2010年版二部附錄ⅩⅢ C進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證試驗、控制菌檢查方法的驗證試驗和樣品檢驗。

2結果

2.1細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證試驗結果

2.1.1常規法取如意金黃散七個廠家26個批次的1︰10供試液各1mL按常規法進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證試驗。結果為24批樣品大腸埃希菌、白色念珠菌試驗組和稀釋劑對照組回收率都＞70%；個別幾個試驗組＜70%而＞50%。而26批樣品金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗組回收率都＜10%，黑曲霉菌的試驗組回收率都＜60%而＞40%；其稀釋劑對照組回收率都＞70%；表明供試品在此條件下對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌有不同程度的抗菌活性。綜合驗證試驗結果得出如意金黃散按常規法進行細菌、霉菌及酵母菌計數，方法學驗證試驗不成立，需要建立新的檢驗方法。常規法的驗證試驗結果同時也表明細菌計數的敏感菌為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；而霉菌及酵母菌計數的敏感菌為黑曲霉菌。

2.1.2#8195;培養基稀釋法、薄膜過濾法、上清液法（1）培養基稀釋法：取1︰10或1︰20供試液1mL，分別注入2個或5個平皿中，每個平皿0.5mL或0.2mL。同時每個平皿加入含50～100cfu的1mL試驗菌，立即傾注相應的培養基，培養后計數。（2）上清液法：取1︰10供試液搖勻后靜置10min，取其上清液按常規法或培養基稀釋法試驗。（3）薄膜過濾法：取1:10供試液搖勻后靜置10min或500r/min低速離心5min，取其上清液1mL于100mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，按薄膜過濾法操作。

26批樣品計數方法按其敏感菌進行培養基稀釋法、上清液法、薄膜過濾法驗證試驗，結果見表1。

表1結果得到枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌在培養基稀釋法0.2mL/皿（1︰10供試液）或培養基稀釋法0.5mL/皿[1︰20供試液或上清液（1︰10）]或薄膜過濾法條件下試驗組和稀釋劑對照組回收率均＞70%，表明供試液在此條件下對其基本無抑菌作用。細菌、霉菌及酵母菌計數按培養基稀釋法0.2mL/皿（1︰10供試液）或培養基稀釋法0.5mL/皿[1︰20供試液或上清液（1︰10）]或薄膜過濾法進行都可行。

2.2控制菌檢查方法的驗證試驗結果

對七個廠家共26個不同批次的樣品按常規法、培養基稀釋法即取1︰10、1︰20供試液各10mL分別加入100mL、200mL和400mL BL增菌液和營養肉湯或亞碲酸鉀肉湯進行兩個控制菌銅綠假單孢菌和金黃色葡萄球菌驗證試驗，結果見表2。

結果為七個廠家共26個不同批次樣品試驗組常規法、培養基稀釋法都檢出控制菌銅綠假單孢菌；1︰10的供試液其培養基稀釋法400mL都檢出金黃色葡萄球菌；1︰20的供試液其培養基稀釋法200mL、400mL都檢出金黃色葡萄球菌；表明該樣品溶液在此條件下對銅綠假單孢菌無抑制作用，銅綠假單孢菌的檢查采用常規法就可以；而該樣品溶液對金黃色葡萄球菌有一定程度的抑制作用，金黃色葡萄球菌的檢查要采用培養基稀釋法。

通過方法學驗證實驗得出，如意金黃散采用培養基稀釋法0.5mL/皿（1︰20）進行細菌、霉菌及酵母菌計數檢查，控制菌銅綠假單孢菌檢查可按常規法進行，金黃色葡萄球菌的檢查采用培養基稀釋法200mL（1︰20）。按照上述驗證過的檢查方法對56批如意金黃散進行微生物限度檢查，結果都符合規定。

3討論

控制菌金黃色葡萄球菌的檢查雖然也可以采用亞碲酸鉀肉湯增菌，但由于亞碲酸鉀微溶于滅菌水，溶解時要適當加溫；亞碲酸鉀對熱不穩定，加溫溫度不能太高，最好溶解后馬上使用，否則極易析出結晶；此外亞碲酸鉀的加入量要適合，不能超過0.002%，否則亞碲酸鉀也抑制金黃色葡萄球菌的良好生長。因此樣品雜菌不多時，建議還是采用營養肉湯增菌。

計數方法采用培養基稀釋法0.2mL/皿（1︰10供試液）或培養基稀釋法0.5mL/皿[1︰20供試液或上清液（1︰10）]或薄膜過濾法都可行，但考慮到樣品數量多，計數方法采用培養基稀釋法（0.2mL/皿，1∶10的供試液），雙碟用量多，費時費力，成本也高；上清液法、薄膜過濾法操作繁瑣些。本著簡便、快速、節約成本及同時考慮到控制菌的檢查，最終選用培養基稀釋法（0.5mL/皿，1∶20的供試液）作為計數方法。

如意金黃散生產廠家不同，即使是同一個生產廠家，其有抑菌作用的原藥材來源不同，其抑菌作用也不一樣，其微生物限度檢查方法也就不同；為了統一制定出適合各廠家同一品種的微生物限度檢查方法，我們對同一廠家3～4個不同批次進行試驗，選取各廠家各批次都可行的方法作為此品種的微生物限度檢查方法。

[參考文獻]

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（收稿日期：2011-04-21）

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