皂角刺總黃酮誘導肝癌HepG2細胞凋亡的實驗研究

【摘要】目的：探討皂角刺總黃酮誘導肝癌HepG2凋亡。方法：應用流式細胞術分別檢測肝癌HepG2細胞線粒體跨膜電位； 建立肝癌荷瘤模型后連續給藥皂角刺總黃酮，檢測外周血中CD3+、CD4+、CD8+及NK 細胞的百分含量并檢測血清中IL-2 和TNF-α 的濃度。結果：皂角刺總黃酮能使線粒體跨膜電位降低，與藥物濃度呈負相關; 與對照組比較， 皂角刺總黃酮能顯著上調小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.05）、CD8+（P＜0.05）及NK 細胞（P＜0.01）的百分含量及血清中IL-2 和TNF-α（P＜0.01）的表達水平。結論：皂角刺總黃酮誘導肝癌HepG2凋亡可能與線粒體通路和干預機體免疫功能，誘導腫瘤凋亡，從而達到抑制腫瘤生長起作用。

【關鍵詞】 皂角刺總黃酮；線粒體跨膜電位；細胞因子

【中圖分類號】Q2 【文獻標識碼】B 【文章編號】1007-8231（2011）11-1888-01

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的41% ［1]。20世紀以來，在我國，肝癌在城市僅次于肺癌，在農村僅次于胃癌，我國肝癌已上升為惡性腫瘤的第二位［2]。原發性肝癌發病隱匿， 迅速發展，患者生存期短。目前，手術是早期肝癌治療的首選方法，放療和化療則是中晚期肝癌及轉移性肝癌常用的治療方法。然而， 手術療法復發率較高;而放療和化療伴有明顯的毒副反應［3]。而以中醫藥為主的綜合治療，對控制肝癌患者病情發展，提高生活質量，延長生存時間有著重要價值。因此，尋找高效低毒的中醫藥已經成為國內外醫藥學家追尋的目標。

皂角刺 (Gleditsia sinensis Lain)是我國傳統中藥材，具有較強的抗腫瘤作用，已被列為抗癌中草藥之一，可用于多種腫瘤的治療。皂角刺總黃酮是皂角刺的提取物。黃酮類化合物是一類天然有機化合物， 廣泛存在于許多藥用植物中， 具有多種潛在的藥用價值， 其抗腫瘤作用的研究已經由來已久， 從20 世紀70年代起就有人發現黃酮類化合物具有較好的抗腫瘤作用［4]。據研究報道：黃芩甙能誘導肝癌細胞BEL27402凋亡和半枝蓮提取物可有效誘導肝癌H22細胞凋亡，其機制可能與降低腫瘤細胞線粒體膜電位有關［6]。曹學鋒等為了探討中藥皂角刺總黃酮的免疫調節作用，利用酶聯檢測其皂角刺總黃酮作用小鼠腹腔巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子(TNF) 的情況， 發現皂角刺總黃酮對TNF 有明顯的抑制作用［7]。

1 材料與試劑

小鼠，雌雄各半，15～18g，購自貴陽醫學院實驗動物中心；CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 抗體及成套試劑盒，購自美國RD公司；interleukin-2（IL-2）、tumor necrosis factor－α（TNF-α）放免試劑盒，購自購自北京華英生物技術研究所; TUNEL檢測試劑盒， 購自羅氏公司；皂角刺總黃酮， 由本課題組制備保存；RPMI- 1640培養液， 購自凱基生物科技發展有限公司; 新生胎牛血清，購杭州四季青生物公司；凱基細胞凋亡羅丹明123染色試劑盒， 購自南京凱基生物科技發展有限公司；BD FACS -Aria流式細胞儀， 美國BD公司生產。

2 方法

2.1 線粒體膜電位的檢測

2.1.1 細胞培養及分組

用含10%新生胎牛血清的RPM I-1640培養液（含雙抗）， 在5% CO2的37℃培養箱中培養。實驗設空白對照組和經皂角刺總黃酮處理的實驗組， 隨機選取對數期生長的肝癌HepG2分成5份， 其中4份分別加入皂角刺總黃酮溶液使其終濃度分別為0.4， 0.8， 1.6， 3.2 mg/ml作為實驗組。其中1份， 加入與實驗組等量體積的培養液作為陰性對照組。

2.1.2 線粒體膜電位的檢測

兩組細胞孵育24 h后， 經消化后用冷PBS（pH7.2）懸浮。取細胞數為1×106個/mL離心管內離心， 冷PBS洗滌3次后，移至流式測定管內離心，用100 l結合緩沖液懸浮細胞。隨后加入羅丹明123染液10mg /mL ，置于 37℃ 5% CO2 培養箱孵育20 min， 取出離心后用培養液洗滌2次， 上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

2.2 皂角刺總黃酮對荷瘤小鼠免疫功能的影響

2.2.1 動物模型建立

抽取HepG2傳代第7d的小鼠腹水2 mL，在無菌條件下，采用滅菌生理鹽水配制成濃度為2×107個/mL 的接種用瘤液。20只小鼠皮下注射接種用瘤液0.2 mL。

2.2.2 動物分組及指標檢測

將20只皮下注射接種用瘤液的小鼠隨機分為對照組和給藥組，另外設10只正常小鼠作為正常組，對照組和正常組均用生理鹽水進行灌胃，用藥組采用皂角刺總黃酮按照0.25 g／kg劑量進行灌胃， 對照組、正常組和用藥組均每日灌胃2 次。灌胃給藥5 d 后眼球采血法獲得外周血，具體操作參照試劑盒說明書采用流式方法檢測CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 及NK 細胞的百分含量和采用放射免疫方法檢測血清中IL-2、TNF-α 的水平。

2.3 統計學處理 所有實驗數據均采用SPSS15.0軟件進行統計分析，數據采用（x±s）表示。

3 結果

3.1 線粒體跨膜電位的檢測

皂角刺總黃酮處理肝癌HepG2作用24h， 經羅丹明123染色后采用流式細胞儀檢測。結果顯示: 與對照組相比，皂角刺總黃酮處理組均明顯低于對照組，有極顯著差異(P < 0. 01)， 且隨皂角刺總黃酮作用濃度的增高而減少，呈為負相關，結果見表1。

表1 線粒體跨膜電位的檢測結果(x±s)

注：*與對照組比較， ** P＜0.01; #與對照組比較， ## P＜0.01

3.2 小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+ 及NK 細胞百分含量的測定

與對照組比較， 用藥組能顯著上調小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.01）、CD8+（P＜0.01）及NK 細胞（P＜0.01）; 與正常組比較， 用藥組能顯著上調小鼠外周血CD3+（P＜0.01）、CD4+（P＜0.01）、CD8+（P＜0.01）及NK 細胞（P＜0.01） 結果見表2。

表2 小鼠外周血CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 及NK 細胞百分含量

注：*與正常組比較， ** P＜0.01；#與對照組比較，## P＜0.01。

3.3 小鼠血清中細胞因子IL-2和TNF-α 的表達

小鼠血清中細胞因子TNF-α和IL-2 的濃度采用放射免疫標記的方法進行檢測。對照組中TNF-α含量最低（1.25±0.35），藥物干預后TNF-α（2.54±0.43）明顯升偏高且接近正常組的值（2.72±0.52）（P＜0.01）。小鼠血清中細胞因子IL-2的濃度測定結果為，與正常組（2.32±0.43）和對照組（2.53±0.57）比較，用藥組小鼠血清中細胞因子IL-2（3.29±0.49）顯著升高（P＜0.01）。

4 討論

4.1 李榮采用皂角刺總黃酮作用于HCTll6細胞，透射電子顯微鏡檢測顯示，經皂角刺總黃酮處理后的細胞出現線粒體腫脹，細胞質濃縮，核固縮，核內染色質聚集于核膜內側成團塊狀或新月狀等凋亡改變。

線粒體通路是抗腫瘤藥物誘導腫瘤細胞凋亡的一條重要途徑。線粒體是細胞進行呼吸鏈、電子傳遞、三羧酸循環和氧化磷酸化的場所，故線粒體也是細胞能量的場所，如果線粒體發生病變則會影響危及細胞生命。在細胞凋亡過程中，線粒體被認為是處于凋亡調控的中心位置，線粒體通路是最普遍的細胞凋亡機制。本研究采用應用流式細胞術分別檢測皂角刺總黃酮肝癌HepG2細胞線粒體跨膜電位變化，研究提示皂角刺總黃酮誘導肝癌細胞凋亡可能是通過某些途徑引起線粒體跨膜電位的下降， 進一步導致MMP通道開放的結果。

4.2 劉明華等建立小鼠肉瘤S180 及小鼠肝癌H22 移植性腫瘤模型， 觀察皂角刺提取物對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用，結果發現皂角刺提取物在50、100 mg/kg 時對S180 的生長抑制率分別為44.59%、53.38%， 對H22 生長抑制率分別為39.88%、46.63%， 且能提高荷瘤小鼠的脾指數和胸腺指數和提高荷瘤小鼠細胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α等細胞因子的表達水平［8]；張宏文和王占彬對產自伏牛山區野生皂角刺， 用醇提取法提取黃酮類化合物等生物活性物質， 研究其對肉仔雞免疫功能的影響，研究結果顯示：日糧中添加皂角刺提取物， 可以提高免疫器官重量和淋巴細胞轉化率， 并有顯著促生長作用( P< 0. 05) ［9]。受這些研究成果的啟發：本研究采用建立肝癌荷瘤模型后連續給藥皂角刺總黃酮，檢測外周血中CD3+、CD4+、CD8+及NK 細胞的百分含量并檢測血清中IL-2 和TNF-α 的濃度。結果與對照組比較， 皂角刺總黃酮顯著上調小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.05）、CD8+（P＜0.05）及NK（P＜0.01）細胞的百分含量及血清中IL-2 和TNF-α（P＜0.01）的表達水平。結論皂角刺總黃酮誘導肝癌HepG2凋亡可能與皂角刺總黃酮干預機體免疫功能，誘導腫瘤凋亡，從而達到抑制腫瘤生長起作用。

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［項目資助] 2010年貴州省科學技術基金（黔科合J字［2010]2262號）和2011年貴州省社會發展科技攻關項目 ［黔科合SY字（2011）3020]資助

作者簡介: 何光志（1977—）， 男， 貴州思南人， 博士， 副教授， 碩士導師，主要從事病原生物學及免疫學研究

(接第1887頁)

而大多抗抑郁藥的起效需2~4周，能否快速有效的抗抑郁治療是非常重要的［4]。坦度螺酮聯合舍曲林治療成年抑郁癥患者取得了較好的療效，較單用舍曲林治療起效更快［5]。本研究在青少年抑郁癥患者中得到了相同的結果，合用組對抑郁和焦慮的療效均優于單用組，且見效較快，而且聯合用藥并不加重藥物的不良反應，與對照組差異無統計學意義。但因兩藥均作用于 5- HT受體，故聯合用藥過程中應警惕發生5-HT綜合征的可能，于開始用藥及調整劑量時應加強觀察。

綜上所述，坦度螺酮聯合舍曲林治療青少年抑郁癥療效優于單用舍曲林，值得臨床推廣。

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