皂角刺總黃酮誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

【摘要】目的：探討皂角刺總黃酮誘導(dǎo)肝癌HepG2凋亡。方法：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞線粒體跨膜電位； 建立肝癌荷瘤模型后連續(xù)給藥皂角刺總黃酮，檢測(cè)外周血中CD3+、CD4+、CD8+及NK 細(xì)胞的百分含量并檢測(cè)血清中IL-2 和TNF-α 的濃度。結(jié)果：皂角刺總黃酮能使線粒體跨膜電位降低，與藥物濃度呈負(fù)相關(guān); 與對(duì)照組比較， 皂角刺總黃酮能顯著上調(diào)小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.05）、CD8+（P＜0.05）及NK 細(xì)胞（P＜0.01）的百分含量及血清中IL-2 和TNF-α（P＜0.01）的表達(dá)水平。結(jié)論：皂角刺總黃酮誘導(dǎo)肝癌HepG2凋亡可能與線粒體通路和干預(yù)機(jī)體免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)起作用。

【關(guān)鍵詞】 皂角刺總黃酮；線粒體跨膜電位；細(xì)胞因子

【中圖分類號(hào)】Q2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1007-8231（2011）11-1888-01

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的41% ［1]。20世紀(jì)以來(lái)，在我國(guó)，肝癌在城市僅次于肺癌，在農(nóng)村僅次于胃癌，我國(guó)肝癌已上升為惡性腫瘤的第二位［2]。原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿， 迅速發(fā)展，患者生存期短。目前，手術(shù)是早期肝癌治療的首選方法，放療和化療則是中晚期肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌常用的治療方法。然而， 手術(shù)療法復(fù)發(fā)率較高;而放療和化療伴有明顯的毒副反應(yīng)［3]。而以中醫(yī)藥為主的綜合治療，對(duì)控制肝癌患者病情發(fā)展，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存時(shí)間有著重要價(jià)值。因此，尋找高效低毒的中醫(yī)藥已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)家追尋的目標(biāo)。

皂角刺 (Gleditsia sinensis Lain)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，已被列為抗癌中草藥之一，可用于多種腫瘤的治療。皂角刺總黃酮是皂角刺的提取物。黃酮類化合物是一類天然有機(jī)化合物， 廣泛存在于許多藥用植物中， 具有多種潛在的藥用價(jià)值， 其抗腫瘤作用的研究已經(jīng)由來(lái)已久， 從20 世紀(jì)70年代起就有人發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有較好的抗腫瘤作用［4]。據(jù)研究報(bào)道：黃芩甙能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞BEL27402凋亡和半枝蓮提取物可有效誘導(dǎo)肝癌H22細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位有關(guān)［6]。曹學(xué)鋒等為了探討中藥皂角刺總黃酮的免疫調(diào)節(jié)作用，利用酶聯(lián)檢測(cè)其皂角刺總黃酮作用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子(TNF) 的情況， 發(fā)現(xiàn)皂角刺總黃酮對(duì)TNF 有明顯的抑制作用［7]。

1 材料與試劑

小鼠，雌雄各半，15～18g，購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 抗體及成套試劑盒，購(gòu)自美國(guó)RD公司；interleukin-2（IL-2）、tumor necrosis factor－α（TNF-α）放免試劑盒，購(gòu)自購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所; TUNEL檢測(cè)試劑盒， 購(gòu)自羅氏公司；皂角刺總黃酮， 由本課題組制備保存；RPMI- 1640培養(yǎng)液， 購(gòu)自凱基生物科技發(fā)展有限公司; 新生胎牛血清，購(gòu)杭州四季青生物公司；凱基細(xì)胞凋亡羅丹明123染色試劑盒， 購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BD FACS -Aria流式細(xì)胞儀， 美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 線粒體膜電位的檢測(cè)

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用含10%新生胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)液（含雙抗）， 在5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組和經(jīng)皂角刺總黃酮處理的實(shí)驗(yàn)組， 隨機(jī)選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝癌HepG2分成5份， 其中4份分別加入皂角刺總黃酮溶液使其終濃度分別為0.4， 0.8， 1.6， 3.2 mg/ml作為實(shí)驗(yàn)組。其中1份， 加入與實(shí)驗(yàn)組等量體積的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組。

2.1.2 線粒體膜電位的檢測(cè)

兩組細(xì)胞孵育24 h后， 經(jīng)消化后用冷PBS（pH7.2）懸浮。取細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL離心管內(nèi)離心， 冷PBS洗滌3次后，移至流式測(cè)定管內(nèi)離心，用100 l結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。隨后加入羅丹明123染液10mg /mL ，置于 37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱孵育20 min， 取出離心后用培養(yǎng)液洗滌2次， 上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 皂角刺總黃酮對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響

2.2.1 動(dòng)物模型建立

抽取HepG2傳代第7d的小鼠腹水2 mL，在無(wú)菌條件下，采用滅菌生理鹽水配制成濃度為2×107個(gè)/mL 的接種用瘤液。20只小鼠皮下注射接種用瘤液0.2 mL。

2.2.2 動(dòng)物分組及指標(biāo)檢測(cè)

將20只皮下注射接種用瘤液的小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，另外設(shè)10只正常小鼠作為正常組，對(duì)照組和正常組均用生理鹽水進(jìn)行灌胃，用藥組采用皂角刺總黃酮按照0.25 g／kg劑量進(jìn)行灌胃， 對(duì)照組、正常組和用藥組均每日灌胃2 次。灌胃給藥5 d 后眼球采血法獲得外周血，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書采用流式方法檢測(cè)CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 及NK 細(xì)胞的百分含量和采用放射免疫方法檢測(cè)血清中IL-2、TNF-α 的水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用（x±s）表示。

3 結(jié)果

3.1 線粒體跨膜電位的檢測(cè)

皂角刺總黃酮處理肝癌HepG2作用24h， 經(jīng)羅丹明123染色后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示: 與對(duì)照組相比，皂角刺總黃酮處理組均明顯低于對(duì)照組，有極顯著差異(P < 0. 01)， 且隨皂角刺總黃酮作用濃度的增高而減少，呈為負(fù)相關(guān)，結(jié)果見表1。

表1 線粒體跨膜電位的檢測(cè)結(jié)果(x±s)

注：*與對(duì)照組比較， ** P＜0.01; #與對(duì)照組比較， ## P＜0.01

3.2 小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+ 及NK 細(xì)胞百分含量的測(cè)定

與對(duì)照組比較， 用藥組能顯著上調(diào)小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.01）、CD8+（P＜0.01）及NK 細(xì)胞（P＜0.01）; 與正常組比較， 用藥組能顯著上調(diào)小鼠外周血CD3+（P＜0.01）、CD4+（P＜0.01）、CD8+（P＜0.01）及NK 細(xì)胞（P＜0.01） 結(jié)果見表2。

表2 小鼠外周血CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 及NK 細(xì)胞百分含量

注：*與正常組比較， ** P＜0.01；#與對(duì)照組比較，## P＜0.01。

3.3 小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2和TNF-α 的表達(dá)

小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-2 的濃度采用放射免疫標(biāo)記的方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組中TNF-α含量最低（1.25±0.35），藥物干預(yù)后TNF-α（2.54±0.43）明顯升偏高且接近正常組的值（2.72±0.52）（P＜0.01）。小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2的濃度測(cè)定結(jié)果為，與正常組（2.32±0.43）和對(duì)照組（2.53±0.57）比較，用藥組小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2（3.29±0.49）顯著升高（P＜0.01）。

4 討論

4.1 李榮采用皂角刺總黃酮作用于HCTll6細(xì)胞，透射電子顯微鏡檢測(cè)顯示，經(jīng)皂角刺總黃酮處理后的細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹，細(xì)胞質(zhì)濃縮，核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)聚集于核膜內(nèi)側(cè)成團(tuán)塊狀或新月狀等凋亡改變。

線粒體通路是抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的一條重要途徑。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸鏈、電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的場(chǎng)所，故線粒體也是細(xì)胞能量的場(chǎng)所，如果線粒體發(fā)生病變則會(huì)影響危及細(xì)胞生命。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體被認(rèn)為是處于凋亡調(diào)控的中心位置，線粒體通路是最普遍的細(xì)胞凋亡機(jī)制。本研究采用應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)皂角刺總黃酮肝癌HepG2細(xì)胞線粒體跨膜電位變化，研究提示皂角刺總黃酮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)某些途徑引起線粒體跨膜電位的下降， 進(jìn)一步導(dǎo)致MMP通道開放的結(jié)果。

4.2 劉明華等建立小鼠肉瘤S180 及小鼠肝癌H22 移植性腫瘤模型， 觀察皂角刺提取物對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皂角刺提取物在50、100 mg/kg 時(shí)對(duì)S180 的生長(zhǎng)抑制率分別為44.59%、53.38%， 對(duì)H22 生長(zhǎng)抑制率分別為39.88%、46.63%， 且能提高荷瘤小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)和提高荷瘤小鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)水平［8]；張宏文和王占彬?qū)Ξa(chǎn)自伏牛山區(qū)野生皂角刺， 用醇提取法提取黃酮類化合物等生物活性物質(zhì)， 研究其對(duì)肉仔雞免疫功能的影響，研究結(jié)果顯示：日糧中添加皂角刺提取物， 可以提高免疫器官重量和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率， 并有顯著促生長(zhǎng)作用( P< 0. 05) ［9]。受這些研究成果的啟發(fā)：本研究采用建立肝癌荷瘤模型后連續(xù)給藥皂角刺總黃酮，檢測(cè)外周血中CD3+、CD4+、CD8+及NK 細(xì)胞的百分含量并檢測(cè)血清中IL-2 和TNF-α 的濃度。結(jié)果與對(duì)照組比較， 皂角刺總黃酮顯著上調(diào)小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.05）、CD8+（P＜0.05）及NK（P＜0.01）細(xì)胞的百分含量及血清中IL-2 和TNF-α（P＜0.01）的表達(dá)水平。結(jié)論皂角刺總黃酮誘導(dǎo)肝癌HepG2凋亡可能與皂角刺總黃酮干預(yù)機(jī)體免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)起作用。

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［項(xiàng)目資助] 2010年貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合J字［2010]2262號(hào)）和2011年貴州省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目 ［黔科合SY字（2011）3020]資助

作者簡(jiǎn)介: 何光志（1977—）， 男， 貴州思南人， 博士， 副教授， 碩士導(dǎo)師，主要從事病原生物學(xué)及免疫學(xué)研究

(接第1887頁(yè))

而大多抗抑郁藥的起效需2~4周，能否快速有效的抗抑郁治療是非常重要的［4]。坦度螺酮聯(lián)合舍曲林治療成年抑郁癥患者取得了較好的療效，較單用舍曲林治療起效更快［5]。本研究在青少年抑郁癥患者中得到了相同的結(jié)果，合用組對(duì)抑郁和焦慮的療效均優(yōu)于單用組，且見效較快，而且聯(lián)合用藥并不加重藥物的不良反應(yīng)，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但因兩藥均作用于 5- HT受體，故聯(lián)合用藥過(guò)程中應(yīng)警惕發(fā)生5-HT綜合征的可能，于開始用藥及調(diào)整劑量時(shí)應(yīng)加強(qiáng)觀察。

綜上所述，坦度螺酮聯(lián)合舍曲林治療青少年抑郁癥療效優(yōu)于單用舍曲林，值得臨床推廣。

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