輕度慢性乙型肝炎患者肝組織中HBcAg及TGF-β1的表達(dá)及臨床意義

[摘要] 目的 了解轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和HBcAg在輕度慢性乙型肝炎患者肝組織中的表達(dá)情況。方法 采用免疫組化法（S-P）檢測10例對照肝組織、90例輕度慢性乙型肝炎患者肝組織TGF-β1、HBcAg的表達(dá)。結(jié)果 90例輕度慢性乙型肝炎患者肝組織TGF-β1隨肝臟纖維化加重而表達(dá)增加，其差異具有顯著性（P＜0.05），正常肝組織組TGF-β1無表達(dá)；輕度慢性乙型肝炎患者肝組織HBcAg陽性率為81.11%，HBcAg是更可靠的HBV復(fù)制指標(biāo)。 結(jié)論 TGF-β1、HBcAg的表達(dá)在輕度慢性乙型肝炎患者肝組織肝纖維化的形成和發(fā)展中起重要作用。TGF-β1、HBcAg的表達(dá)與早期臨床診斷及治療和判斷預(yù)后密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 輕度轉(zhuǎn)氨酶升高；慢性乙型病毒性肝炎；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；乙肝核心抗原；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R512.6+2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）26-17-03

Expression and Clinical Significance of TGF-β1 and HBcAg in Chronic Hepatitis B Virus Carriers with Slight Unusual Liver Function

ZHUge lu JIN Lingxiang LIN Wei PAN Chenwei FANG Peipei ZHOU Guangyao

Infectious Department，the 2nd Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To detect the expression of transforming growth factorβ1（TGF-β1） and HBcAg in chronic hepatitis B virus carriers with slight unusual liver function. Methods All the livers were detected by immunohistochemistry（S-P）. Results With the increase of liver fibrosis and increased expression of TGF-β1， there was significant difference（P＜0.05）. There were no expression of TGF-β1 in normal liver tissues. The positive rate of HBcAg was 81.11% in the research group，it was more reliable copy index of HBV. Conclusion TGF-β1 and HBcAg may play an important role in the development of liver fibrosis，especially they are tightly correlated with clinical pathologic factors.

[Key words] Slight unusual liver function； Chronic hepatitis B； Transforming growth factor-β1（TGF-β1）；HBcAg；Immunohistochemistry

乙肝病毒復(fù)制是導(dǎo)致慢性乙肝患者疾病進(jìn)展的根源，故目前針對慢性乙肝最基礎(chǔ)的治療是抗病毒治療。慢性乙肝抗病毒治療的一般適應(yīng)證為ALT≥2ULN（正常上限值）且病毒復(fù)制活躍的患者。但近年研究表明，ALT和（或）AST＜2ULN甚至轉(zhuǎn)氨酶正常的慢性HBV感染患者，同樣可能存在肝組織的改變。由此在2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》中針對乙肝抗病毒治療適應(yīng)證中，對患者基線ALT水平的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了具體的更改，如對ALT＞ULN且年齡＞40歲者，也應(yīng)考慮抗病毒治療等[1]。本實(shí)驗(yàn)通過探討ALT在1～2ULN的慢乙肝患者肝組織中的轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和HBcAg的表達(dá)及其分布情況，以期為該類患者是否需進(jìn)行抗病毒治療提供早期依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2007年1月～2010年5月溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院存檔蠟塊和外科切除肝組織標(biāo)本，共90例。全部病例ALT和（或）AST 1～2倍ULN，半年內(nèi)未使用過抗病毒及保肝治療，一年內(nèi)每三個(gè)月復(fù)查一次肝功能，排除肝穿刺的禁忌證。除外重疊其他嗜肝病毒感染、合并其他非嗜肝病毒感染、脂肪肝、酒精性肝病、淤膽型肝炎、藥物性及自身免疫性肝病病例。上述病例的臨床及病理均符合2000年9月中華醫(yī)學(xué)會(huì)西安會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)[2]。其中男性62例，女性28例，年齡17～58歲，平均（31.5±14.3）歲。90例肝組織標(biāo)本予10%甲醛固定，石蠟包埋。選擇10例正常肝組織對照，為外科手術(shù)中獲得。切片處理：蠟塊切成4μm厚，連續(xù)切片4張，55℃烤箱內(nèi)烤，常規(guī)和免疫組織化學(xué)染色。試劑：兔抗人TGF-β1 多克隆抗體、鼠抗人HBcAg多克隆抗體（購自福建邁新公司）。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

采用S-P法（鏈霉菌抗生物蛋白-過氧化酶聯(lián)接法）。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷

以PBS代一抗為陰性對照。細(xì)胞漿染色呈棕黃色為TGF-β1陽性細(xì)胞，用HPIAS 1000圖文分析系統(tǒng)對TGF-β1圖象進(jìn)行定量分析，隨機(jī)選取 10個(gè)視野，測定每一視野中TGF-β1的含量，以陽性表達(dá)區(qū)域占全視野面積的百分比表示，取平均值。HBcAg蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色，主要定位于細(xì)胞漿。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，免疫組化染色陽性細(xì)胞分成4個(gè)等級：無棕黃染色為陰性；＜10個(gè)細(xì)胞為+；10～20細(xì)胞為++；＞20個(gè)細(xì)胞為+++。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同一指標(biāo)組間比較用方差分析SNK-q檢驗(yàn)，兩指標(biāo)間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理結(jié)果

所有患者均有不同程度的肝組織受損，其中病理診斷為慢性乙型肝炎輕度59例，中度以上的為24例（慢性乙型肝炎中度11例，重度13例），有7例病理診斷為肝硬化。83 例病理診斷為慢性乙型肝炎的患者中，G≥2者27例（32.53%）， S≥2者25例（30.12%）。

2.2 輕度慢性乙型肝炎患者肝組織炎癥分級及纖維化分期

剔除7例病理診斷為肝硬化的患者，余下的83例慢性乙型肝炎患者，其炎癥分級呈G1～G3 分布；纖維化分期呈S0～S3分布。見表1。

2.3 輕度慢性乙型肝炎患者肝組織TGF-β1 免疫組化結(jié)果

正常對照肝組織組，TGF-β1未見表達(dá)。TGF-β1 染色陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿呈棕黃色。S0期未見明顯陽性表達(dá)；S1期陽性物質(zhì)主要分布在肝竇、竇周細(xì)胞、壞死灶與匯管區(qū)，但著色不深；S2期分布部位與S1期相似，但染色稍有加深；S3期在纖維間隔、肝細(xì)胞中均有分布，且著色較前加深；S4期肝細(xì)胞內(nèi)可見大量染色陽性物質(zhì)。

2.4 輕度慢性乙型肝炎患者肝組織TGF-β1圖像定量分析及其與肝纖維化的關(guān)系

見表2。

表2 輕度慢性乙型肝炎肝組織TGF-β1與肝臟纖維化分期的關(guān)系纖維化分期（S）病例數(shù)TGF-β1（10-2）

注：S0：S1～S4 q值分別為8.95、12.02，16.53，32.36；S1：S2～S4 q值分別為4.96、12.65，31.78；S2：S3～S4 q值分別為9.06、28.33；S3：S4 q值為18.51；P均＜0.05

2.5 HBcAG在輕度慢性乙型肝炎患者肝組織中的表達(dá)

90例患者肝組織中HBcAG表達(dá)強(qiáng)陽性者8例（8.89%），中等陽性表達(dá)者28例（31.11%），弱陽性表達(dá)者37例（41.11%），陰性表達(dá)者17例（18.89%）。而10例正常肝組織中未見陽性表達(dá)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

慢性乙肝最基礎(chǔ)的治療為抗病毒治療。現(xiàn)公認(rèn)的慢性乙肝抗病毒治療的主要適應(yīng)證為轉(zhuǎn)氨酶≥2ULN且病毒載量高的患者。雖然，近年來國內(nèi)外學(xué)者對ALT水平正常或＜2ULN的患者進(jìn)行了大量的肝臟病理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)該類患者存在不同程度的肝臟炎癥反應(yīng)和纖維化。2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》對乙肝患者抗病毒治療時(shí)的基線轉(zhuǎn)氨酶水平的情況也做了更為具體的說明，但至今對ALT和（或）AST在1～2ULN的慢性乙肝患者是否需行抗病毒治療仍未達(dá)成共識(shí)。

肝纖維化系由肝臟慢性損傷引起細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積所致。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）通過對肝星狀細(xì)胞（HSC）、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等的直接作用以及對與纖維化有關(guān)的其他生長因子和各種酶類施加廣泛影響，促進(jìn)ECM合成并抑制其降解，是目前已知的最強(qiáng)的刺激形成肝纖維化因子，在肝纖維化的啟動(dòng)、進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。在正常肝臟組織中，TGF-β1一般無或僅有極少存在。本試驗(yàn)中提示在肝纖維化狀態(tài)下，肝組織的纖維間隔、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、竇周細(xì)胞、肝細(xì)胞等為其較強(qiáng)的表達(dá)部位。TGF-β1可使 HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，使膠原纖維分泌增多，促進(jìn) ECM合成，導(dǎo)致肝纖維化。活性的TGF-β1可以通過存在于細(xì)胞表面上的TGF-β1受體系統(tǒng)完成其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，如果能抑制TGF-β1的生成，則能阻斷TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而在根源上阻止肝纖維化的進(jìn)展。以TGF-β1為靶向的抗纖維化研究正在得到關(guān)注[3]。

本實(shí)驗(yàn)觀察了輕度慢性乙型肝炎患者肝組織中，肝纖維化在各個(gè)分期TGF-β1在肝組織內(nèi)的表達(dá)及分布水平，結(jié)果提示S0期TGF-β1基本沒有表達(dá)；S1期TGF-β1主要分布于竇周細(xì)胞、肝血竇壁；S2期的情況與S1期類似，但染色有所加深；S3期TGF-β1在纖維間隔、肝細(xì)胞內(nèi)較多分布；S4期TGF-β1在纖維間隔、肝細(xì)胞內(nèi)大量分布。與康海燕[4]等研究報(bào)道的TGF-β1與肝纖維化的關(guān)系相一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，輕度慢性乙型肝炎患者肝組織TGF-β1隨肝臟纖維化加重而表達(dá)增加。

細(xì)胞免疫和體液免疫在肝細(xì)胞受損的過程中起重要作用，在慢性乙肝的發(fā)病機(jī)制中，前者占主導(dǎo)地位。受乙肝病毒感染的肝細(xì)胞膜上HBcAg是T淋巴細(xì)胞攻擊的靶抗原。HBcAg是組成乙肝病毒核殼的主要部分，是乙肝病毒在體內(nèi)復(fù)制的重要指標(biāo)。編碼HBcAg的開放閱讀框中含有2個(gè)起始密碼子AUG，2個(gè)AUG間的區(qū)域?yàn)槲覀兂Ｌ峒暗那癈區(qū)，分別合成HBcAg/p21、HBeAg/p18。HBcAg/p21由第2 個(gè)起始密碼子編碼，HBeAg/p18由第1個(gè)起始密碼子開始合成，若前C區(qū)基因發(fā)生突變，可表達(dá)HBcAg，但不能表達(dá)HBeAg[5]。說明HBcAg作為HBV復(fù)制和傳染性指標(biāo)比HBeAg更為可靠[6]。臨床研究表明，血清 HBeAg、HBV-DNA與肝組織內(nèi)的 HBcAg有一致性，都是 HBV復(fù)制的指標(biāo)[7]。本研究中的肝組織中HBcAg陽性率為81.11%，陽性率較高，與入選患者的HBV-DNA載量較高有關(guān)（HBV-DNA 104～106者29例、 HBV-DNA 107～109者61例）。劉建芳等[8]報(bào)道血清 HBV-DNA與肝組織HBsAg、HBcAg呈正相關(guān)。肝組織內(nèi) HBcAg的存在是 HBV復(fù)制指標(biāo)，HBcAg有很強(qiáng)的免疫原性，能引起宿主較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致疾病的進(jìn)展。

TGF-β1在肝纖維化的啟動(dòng)、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，TGF-β1的局部高濃度與肝纖維化密切相關(guān)。HBcAg是更可靠的HBV復(fù)制指標(biāo)，乙肝病毒復(fù)制是疾病進(jìn)展的根源。因此，檢測TGF-β1、HBcAg的表達(dá)可對輕度慢性乙型肝炎病變從分子水平進(jìn)行評估，有利于該類患者早期診斷及確定合理的臨床治療和預(yù)后的判斷。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì). 慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J]. 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，12（1）：1-15.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì). 病毒性肝炎防治方案[J]. 肝臟，2000，5：257-263.

[3] 葉偉東，陳永平，徐少杰，等. 肝纖維化大鼠肝臟 Bcl-2、Bax增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)及重組轉(zhuǎn)化生長因子β1疫苗對其表達(dá)的影響 [J]. 中華傳染病雜志，2007，25（7）：398-402.

[4] 康海燕，董江龍，王建彬，等. 260例乙肝患者肝組織轉(zhuǎn)化生長因子β1與肝纖維化及肝功能的關(guān)系[J]. 臨床肝膽病雜志，2009，25（1）：61-62.

[5] 張樹林. 乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物臨床意義的再認(rèn)識(shí)[J]. 國外醫(yī)學(xué)：流行病學(xué)與傳染病學(xué)分冊，1993，20（2）：57.

[6] Sagnelli E. Radioimmunoassay for hepatitisB core antigen[J]. Clin Chem，1982，25：351.

[7] 韋艾凌. 疲痛消膠囊抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2002，29（7）：446-447.

[8] 劉建芳，張玉喜，李又平，等. 慢性乙型肝炎患者肝組織中 HBsAg、HBcAg的表達(dá)與血清HBV-DNA含量的關(guān)系[J]. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2007，29（9）：782-783.

（收稿日期：2011-07-22）