薯蕷皂苷元對人宮頸癌細胞增殖的影響

[摘要] 目的 研究薯蕷皂苷元對人宮頸癌細胞增殖的影響。方法 培養人宮頸癌細胞株Hela，不同濃度的薯蕷皂苷元干預24、48、72h，采用MTT、EdU檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞周期，Western Blot檢測細胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin B1。結果 薯蕷皂苷元在20μmol/L濃度時抑制Hela細胞活力（P＜0.01），呈現量效和時效特征；薯蕷皂苷元作用后EdU陽性細胞明顯減少，薯蕷皂苷元引起G0/G1期細胞阻滯，減少S期細胞，降低Cyclin D1蛋白表達，而對Cyclin B1蛋白表達沒有明顯影響。結論 薯蕷皂苷元通過阻滯細胞G0/G1期來抑制人宮頸癌Hela細胞株的增殖。

[關鍵詞] 薯蕷皂苷元；宮頸癌；細胞增殖；細胞周期

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）26-05-03

Influence of Diosgenin on Cell Proliferation in Human Cervical Cancer

ZHANG Wenxiu

Department of Obstetrics and Gynecology， the First People's Hospital of Jining City， Jining 272100， China

[Abstract] Objective To evaluate the possible effects of diosgenin on cell proliferation in human cervical cancer. Methods The Hela cells were treated with different concentrations of diosgenin for 24， 48 and 72 hours， respectively. Cell proliferation was tested by MTT and EdU assay， and cell cycle analysis was performed by FACS. In addition， Cyclin D1 and B1 protein expressions were tested by Western Blotting， respectively. Results We found that 20 μmol/L diosgenin began to markedly inhibit cell viability （P＜0.01） and there were dose-dependent and time-dependent effects of diosgenin on cell viability. We found that the number of EdU+ cells （EdU-labeled replicating cells） was significantly reduced in diosgenin treatment group. Diosgenin decreased expression of cyclin D1 and arrested them at the G0/G1 phase. Conclusion Diosgenin inhibits the proliferation of human cervical cancer cells by blocking them at the G0/G1 phase.

[Key words] Diosgenin； Cervical cancer； Cell proliferation； Cell cycle

現代藥理研究表明薯蕷皂苷及其衍生物具有免疫調節、降血脂、抗衰老、抗氧化、抗關節炎、保護胃黏膜、祛痰、溶血、脫敏、滅釘螺、抗腫瘤、抗艾滋病、抗血小板聚集、增強心臟收縮力、減慢心率、抗動脈硬化、改善微循環等多種藥理活性[1，2]。宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，發病率呈逐年上升和年輕化趨勢；近年來，國內外對化療在宮頸癌的應用進行基礎和臨床方面研究，取得較大進展。本研究觀察薯蕷皂苷元對人宮頸癌Hela細胞株增殖和細胞周期的影響，探討其對治療宮頸癌的可能作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人宮頸癌細胞株購自上海瑞齊生物科技有限公司，用含10%新生牛血清（NBS，Gibco，USA）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養基（Gibco，USA）培養；細胞培養孵箱內培養條件：5%CO2，95%空氣，溫度37℃，濕度98%。細胞在培養皿中密度達到70%～80%時，進入實驗干預。

1.2 薯蕷皂苷元貯存液配制

原粉為美國Sigma公司產品，按照說明書要求，溶于酒精配制100mM貯存液，無菌分裝-80℃保存備用。工作液酒精濃度0.5%。分組實驗，無菌吸取貯存液加入饑餓培養液中，稀釋為15μM、20μM、25μM、30μM。

1.3 細胞活力的測定

細胞密度培養至70%～80%，消化后轉至96孔板（每孔細胞數約1×104），含10% NBS的DMEM培養基培養2～3d，含0.2% NBS的DMEM培養基培養（同步化）24h，之后進入實驗干預階段。對照組與薯蕷皂苷元15μM組、20μM組、25μM組、30μM組，分別作用24h、48h和72h；采用MTT方法檢測細胞活力（中國凱基，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒）。Dilution Buffer將5×MTT稀釋成1×MTT；每孔加1×MTT 50μL，37℃孵育4h，MTT還原為甲臜；吸出上清液，每孔加DMSO 150μL溶解甲臜，平板搖床搖勻；酶標儀在550nm波長處檢測每孔的光密度。

1.4 細胞增殖的檢測

取對數生長期細胞，以每孔6000～10000細胞接種于96孔板，置培養箱培養過夜；根據實驗需要進行藥物處理，對照組與25μM薯蕷皂苷元作用6h、12h；采用EdU試劑盒（中國銳博，C00031 Apolloreg;567）檢測細胞增殖，熒光顯微鏡下所有細胞核顯示藍色（Hoechst染色），增殖中的細胞核顯示紅色（EdU染色）。

1.5 細胞周期檢測

對照組與25μM薯蕷皂苷元作用24h、48h；細胞干預消化結束，PBS洗后離心，0.4mL PBS重懸細胞轉至Tube中輕輕吹打（防止細胞破碎），加50μL PI至終濃度為65μg/mL，冰浴中避光染色30min；300目（孔徑40～50μm）尼龍網過濾，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.6 Cyclin D1、Cyclin B1蛋白表達水平檢測

對照組與25μM薯蕷皂苷元作用6h、12h；細胞貼壁生長于直徑4cm的培養皿，分組培養不同時間后提取蛋白，測定蛋白濃度，采用Western Blot檢測Cyclin D1、Cyclin B1蛋白表達水平。抗體：小鼠單克隆β-actin一抗（Abcam，6926），小鼠抗人Cyclin D1單克隆抗體（sc-8396），兔抗人Cyclin B1單克隆抗體（Abcam，4138），山羊抗小鼠-HRP標記抗體（ZB2305）購自北京中杉公司，小鼠抗兔-HRP標記抗體購自Cell Signaling公司。

1.7 統計學處理

所有實驗重復3次以上，采用SPSS13.0統計軟件包進行統計分析，計量資料用均數±標準差（χ±s）表示，組間均數比較采用方差分析與t檢驗。檢驗水平α=0.05。

2 結果

2.1 MTT結果

20μmol/L薯蕷皂苷元作用24h后，開始明顯抑制宮頸癌Hela的細胞活力（P＜0.05），呈現量效和時效的影響，隨著薯蕷皂苷元濃度增加和作用時間的延長，抑制效果明顯增強。根據MTT結果和參考文獻，選用25μmol/L濃度的薯蕷皂苷元進行以下實驗。見圖1。

圖1 不同濃度薯蕷皂苷元對人宮頸癌細胞株Hela細胞活力的影響

2.2 EdU結果

EdU陽性細胞數（即增殖期細胞）在薯蕷皂苷元處理6h和12h后明顯減少；作用12h EdU陽性細胞數減少更明顯。見圖2。

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期

25μmol/L薯蕷皂苷元阻滯細胞在G0/G1期，S期細胞減少（P＜0.05）；G2/M期細胞沒有明顯變化。作用24h和48h，兩者之間無明顯差異。見表1。

2.4 Western blot檢測結果

25μmol/L薯蕷皂苷元作用6h后對Cyclin D1蛋白水平無明顯影響；作用12h后降低Cyclin D1蛋白的水平；Cyclin B1蛋白水平無明顯變化。見圖3。

圖3 薯蕷皂苷元對細胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin B1的影響

3 討論

子宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，傳統的治療方案認為宮頸癌對化療藥物不敏感，僅在晚期和復發患者中將化療作為綜合治療一部分。近年來大量基礎和臨床研究表明，化療在宮頸癌的治療中，對局部治療手段不能控制的腫瘤周圍、肉眼看不到的微小轉移灶以及可能存在的全身亞臨床轉移有一定療效，進而確定化療在治療宮頸癌的地位?；熕幬锿ㄟ^抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡起到抗腫瘤作用，因此尋找新的抑制宮頸癌細胞增殖或誘導凋亡的藥物，成為治療宮頸癌的新策略。

國外研究表明薯蕷皂苷元具有顯著抗增殖和誘導凋亡作用。體內抗腫瘤的效用方面，Malisetty等[3]報道在嚙齒動物結腸癌模型中，薯蕷皂苷元在起始、始發、進程中能夠抑制結腸癌前病變，表明它可以有效推遲和終止結腸癌前病變的出現和發展。Raju等[4]研究也證實，薯蕷皂苷元阻止結腸癌變早期階段的進程。此外，體外抗腫瘤效用方面，Shishodia等[5]檢測體外的薯蕷皂苷元對60種人類腫瘤細胞系/株的細胞毒作用，結果顯示薯蕷皂苷元的細胞毒作用可對抗NCI人類腫瘤的白血病、實體瘤等大多數細胞株。MTT結果提示薯蕷皂苷元抑制宮頸癌Hela細胞活力，15μmol/L薯蕷皂苷元作用24h后不能明顯抑制細胞活力，20μmol/L薯蕷皂苷元作用24h開始明顯抑制宮頸癌Hela的細胞活力，隨著濃度增加抑制作用更加明顯，呈現量效和時效作用；根據MTT和其他文獻結果，采用25μM薯蕷皂苷元進行EdU實驗及下一步實驗，進一步證明其抑制宮頸癌Hela細胞株增殖的作用。

Cyclin D1在G1/S期轉換過程中起重要作用，是細胞DNA合成以及通過G1/S期檢測點的正向調控因子；Cyclin B1是典型G2/M期周期蛋白，促進細胞從G2期進入M期完成有絲分裂。研究結果表明薯蕷皂苷元阻滯細胞G0/G1期，減少S期細胞；25μmol/L薯蕷皂苷元作用6h對Cyclin D1蛋白水平無明顯影響，作用12h和48h后Cyclin D1蛋白水平降低；薯蕷皂苷元對Cyclin B1蛋白水平影響無明顯差異，與相關文獻報道一致。

綜上所述，薯蕷皂苷元能抑制宮頸癌Hela細胞株增殖，通過降低Cyclin D1蛋白表達而引起G0/G1期細胞阻滯，薯蕷皂苷元抑制增殖作用有明顯的量效和時效影響。遺憾的是，由于時間所限制沒有進行相關細胞信號通路的研究，我們將在下一步實驗，重點研究薯蕷皂苷元影響宮頸癌Hela細胞株的信號通路。

[參考文獻]

[1] McAnuff MA，Harding WW，Omoruyi FO，et al. Hypoglycemic effects of steroidal sapogenins isolated from Jamaican bitter yam. Dioscorea polygonoides[J]. Food Chem Toxicol，2005，43（11）：1667-1672.

[2] Turchan-Cholewo J，Liu Y，Gartner S，et al. Increased vulnerability of ApoE4 neurons to HIV proteins and opiates： protection by diosgenin and L-deprenyl[J]. Neurobiol Dis，2006，23（1）：109-119.

[3] Malisetty VS，Patlolla JMR，Raju J，et al. Chemoprevention of colon cancer by diosgenin， a steroidal saponin constituent of fenugreek[J]. Proc Amer Assoc Cancer Res，2005，46：2473.

[4] Raju J，Patlolla JM，Swamy MV，et al. Diosgenin， a steroid saponin of Trigonella foenum graecum （Fenugreek）， inhibits azoxymethane-induced aberrant crypt foci formation in F344 rats and induces apoptosis in HT-29 human colon cancer cells[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13（8）：1392-1398.

[5] Shishodia S，Aggarwal BB. Diosgenin inhibits osteoclastogenesis， invasion， and proliferation through the downregulation of Akt， I kappa B kinase activation and NF-kappa B-regulated gene expression[J]. Oncogene，2006，25（10）：1463-1473.

（收稿日期：2011-08-01）