園林植物組織培養過程中褐化問題的研究

摘 要:綜述了園林植物組織培養過程中褐變發生的機理、影響褐化的因素及控制褐化的方法等領域的研究進展。

關鍵詞:園林植物 組織培養 褐化 褐化控制

中圖分類號:TU986文獻標識碼:A文章編號:1674-098X(2011)04(a)-0126-02

在園林植物組織培養過程中褐化現象是普遍存在的，它與菌類污染、過度含水化(即玻璃化)并稱為植物組織培養的三大難題，而控制褐化比控制污染和玻璃化更加困難。因此褐化能否得到有效的控制是對某些植物的組織培養能否取得成功起到決定性的作用。在組織培養過程中存在褐化現象的園林植物主要有:蝴蝶蘭、銀杏、非洲菊、牡丹、芍藥、鳳梨、瑞香、玫瑰、大巖桐、大花茉莉、倒掛金鐘、觀賞羽衣甘藍、花燭、郁金香、飛燕草、風鈴草、紫葉黃櫨、桉樹、東北紅豆杉、巴拉圭冬青、茶樹等。本文就近年來關于園林植物組織培養中褐化現象的研究進展作一綜述。

1 褐化的機理

在植物組織培養過程中所說的褐化是指外植體在誘導脫分化或再分化過程中，自身組織從表面向培養基釋放褐色物質，以至培養基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。

褐化的發生與外植體組織中所含的酚類化合物和多酚氧化酶活性有直接的關系，很多植物特別是某些木本植物，如棗、銀杏等都有高含量的酚類化合物，這些化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩定。當外植體組織被切割后接種時，切口附近的細胞受到傷害， “分隔效應”被打破，酚類化合物與多酚氧化酶接觸后經其催化迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類物質又會在酪氨酸酶等酶的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，使切面迅速變成棕褐色或暗褐色，這些褐色物質會逐漸擴散到培養基中，進一步引起其他酶系統失活，毒害整個外植體組織，抑制外植體的脫分化、再分化和組培苗的正常生長。

2 影響褐化的因素

2.1 不同外植體對褐化的影響

2.1.1 材料的年齡和大小

褐化隨材料的年齡和組織木質化的程度而增加，Chever分析歐洲栗的酚含量變化的結果表明，幼嫩材料酚類化合物含量少，而成齡材料比較多。

外植體大小對褐化的影響，表現為小的材料更容易發生褐化，相對較大的材料則褐化的程度較輕。何康等(2005年)也指出，在南方紅豆杉愈傷組織培養中，嫩葉切塊小于1cm×1cm時，葉塊易褐變死亡。另外切口越大，酚類物質的被氧化面也越大，褐化程度就會更嚴重。

2.1.2 取材的時間

何松林(2005年)等在牡丹葉柄離體培養時發現，冬春季取材褐化死亡最低，夏季時取材容易被氧化褐化。這是由于植物體內酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生長季節并不相同，一般在生長季節含有較多的酚類化合物。卡德蘭、棗也有類似的情況。

2.1.3 取材的部位

張明麗等(2005年)在金葉紅瑞木離體培養中發現，生長期取嫩枝段作外植體時， 枝條上部頂生枝段的褐化率遠遠高于下部腋芽莖段，褐化率高達62.7%，而下部莖段的褐化率只有4.3%。隨著芽位的降低，褐變率顯著增加。

2.2 培養基對褐化的影響

培養基的狀態影響褐變的程度。許多實驗表明，液體培養基可減輕外植體的褐化，液體培養基再加上濾紙或棉花做成紙橋效果會更好。鐘紅梅報道鳳梨用液體培養可以減輕褐變。

在初代培養時，培養基中無機鹽濃度過高可引起酚類分泌物大量產生，導致外植體褐變，降低無機鹽濃度可減少酚類物質的分泌，從而減輕褐變。葉曉青等在蝴蝶蘭原球莖的增殖培養研究中發現，1/2MS或改良MS較MS效果好，減少MS中大量元素和部分微量元素及有機成分有利于原球莖的增殖和分化。

還有報道，高濃度的糖、絲氨酸及硼都可以加劇褐變的發生，而氨態氮過高也有類似結果。此外，培養基的PH值可能對酚類和酚氧化酶結合部位產生影響。

2.3 生長調節劑對褐化的影響

在初代培養中，高濃度的生長調節劑嚴重影響褐變的程度。BA或KT不僅能促進酚類化合物的合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增強酚類物質氧化成醌類物質的能力，從而加劇褐化的程度。

2.4 培養條件及其他因素

光照能促進多種植物組織培養中酚的氧化，與酚類物質的合成和氧化相關的酶都是光誘導型，因此將培養物在低光照或置于暗光中培養一段時間能減輕褐變。楊博等(2003年)在玫瑰的初代培養中，對外植體進行不同程度的田間遮蔭處理，發現重度遮蔭可使玫瑰初代培養的褐化指數降低，萌芽率提高，總酚量降低，證實了光照強度影響總酚的合成。

溫度也對褐化影響很大，高溫能促進PPO的活性，促進酚類氧化。此外，培養基的放置方式、抗氧化劑的使用以及轉瓶周期等都不同程度地影響外植體的褐化程度。

3 控制褐化的方法

3.1 母株和外植體的預處理

對母株進行遮光處理，可以減輕一些品種的褐化程度。楊博和韓振海在玫瑰的初代培養田間遮蔭處理時發現，重度遮光處理下褐化的百分比最低，，而自然光照和輕度遮光處理下，褐化百分比分別為88.3%和79.6%。切割外植體時在抗氧化劑或吸收劑中進行，或用這些藥劑保存剛切下來的組織，由于隔離了切面傷口的氧化和抑制PPO的活性等原因，可以減少褐化。在油棕、紅豆杉等組織培養上可采用此法。但對那些組織快速氧化的植物，如蘋果、油橄欖等用抗氧化劑處理則沒效果。預培養有助于避免酚類物質和其它生長抑制物的毒害作用。在20年生的檸檬桉母本植株上采集的莖芽，需先在液體培養基上培養3d，然后再在半固體培養基上培養。茶樹帶少量葉的莖段預培養15d，均有助于減輕褐化。

3.2 培養基中加入防褐劑

許多報道認為，在培養基中加入抗氧化劑可以明顯減少褐變生。劉蘭英在核桃組織培養中發現，當培養基中Vc含量為0.5 g/L時，褐變率為68.4%，5.0g/L時則為55.4%。陳學森等在銀杏組織培養中應用植酸作抗氧化劑也取得了一定成效。吳震先等認為，SO2可以抑制PPO的活性。

另據報道，PVP、AC(活性炭)等吸收劑也可以減輕褐變的發生。如蝴蝶蘭。但也有報道吸收劑有時也有副作用，如AC不僅能吸收有毒的物質，同時它還能吸附植物生長所必須的營養元素。

3.3 選擇適宜的培養基和培養條件

包括溫度、光照、培養基的PH值和狀態，激素的種類和濃度，基礎培養基的選用等。李用改良MS或C2d、芍藥使用1/2MS培養基可減輕褐化;在初始培養時把植物的外植體處于不適合酚類合成的條件下，如黑暗或弱光中培養，可抑制酚類的氧化。

加快繼代轉瓶的速度，及時更換新鮮培養基，可以減輕酚類物質對培養材料的毒害作用。如蘭花、紫葉黃櫨、大花飛燕草、瑞香在莖尖或腋芽培養中使用了這個方法。

4 結語

存在于園林植物細胞內的酚氧化酶有多種，而目前研究的PPO(多酚氧化酶)，對其它的酚氧化酶在褐變中所起的作用機理和程度研究較少。

由于不同的植物中酚氧化酶的生化特性有所差異，因此，不同園林植物組織培養中解決或減輕褐變的方法有所不同。

由于不同植物中酚氧化酶的活性不同，所含酚類物質的含量和種類不同，不同植物褐變發生的程度差異較大。

影響褐變的環境因素除了光照、溫度外，還有O2及其它因素，但在這些方面報道較少。

參考文獻

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