花卉體細胞胚發生的研究進展

摘要：植物體細胞胚的發生在花卉再生研究中具有重要的意義，文章綜述了植物體細胞胚發生包括胚性組織的誘導與擴增、體細胞胚的成熟、體細胞胚萌發與植株轉化的發生過程，比較了內環境因素及植物激素對花卉體細胞胚發生的影響，為進一步研究花卉體細胞胚高效再生體系的建立提供借鑒。

關鍵詞：花卉；體細胞胚；植物激素

中圖分類號：Ｓ６８；Ｑ９４４．４；Ｑ９４６．８８５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）20－4112-04

Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｆｌｏｗｅｒｓ

ＹＵ Ｚｉ－ｔｉｎｇ１，２，ＨＵＡＮＧ Ｃｏｎｇ－ｌｉｎ２，ＬＵＯ Ｃｈａｎｇ２，ＺHＡＮＧ Ｘｉｕ－ｈａｉ２，ＷＵ Ｚｈｏｎｇ－ｙｉ２，ＣＨＥＮＧ Ｘｉ２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃａｐｉｔａｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００48， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｇｒｏ－bｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９７， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗａｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｏ ｆｌｏｗｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ． Ｔｈｅ generating progresses of ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ， ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ， ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ were ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｉｔ provided reference for the foundation of ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｆｌｏｗｅｒ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｌｏｗｅｒ； ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｓ； ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ

植物體細胞胚發生（Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）是指體細胞在特定條件下，未經性細胞融合而通過與合子胚類似的發育途徑形成新個體的形態發生過程。經體細胞胚發生過程形成的類似合子胚的結構稱為胚狀體或體細胞胚。１９５８年，Ｓｔｅｗａｒｄ等首次從胡蘿卜（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ．ｖａｒ．ｓａｔｉｖａ ＤＣ．）懸浮細胞中獲得了體細胞胚，之后的５０多年里，對體細胞胚的研究取得了很大的進展。與傳統的器官發生不同，體細胞胚在發生的早期階段就有兩極性，即胚根與胚芽，而與母體細胞或外植體的維管束無直接聯系，說明胚狀體一開始就是一個完整植株的雛形，可以通過類似胚柄結構從外植體或愈傷組織中取得營養［１］。文章綜述了植物體細胞胚發生的幾個階段性過程，比較了影響體細胞胚發生的內環境因素，為進一步研究花卉體細胞胚高效再生體系的建立提供參考。

１體細胞胚的發生過程

一般植物體細胞胚的發生包括胚性組織的誘導與擴增、體細胞胚的成熟、體細胞胚萌發與植株轉化３個基本過程［２］。

胚性組織的誘導與擴增（即胚性細胞團的分裂）有３種不同方式，一是由多個致密細胞組成的胚胎頭部細胞產生多次分裂，二是由大液泡的胚柄細胞產生分裂，三是由單個胚性細胞進行分裂［２］。這一時期的外植體多數需要在暗培養條件下進行，可以得到半透明的未成熟胚性組織。

體細胞胚的成熟是指從體細胞胚發生到萌發前的干化這段時期，體細胞胚成熟需要滿足形態上和生理上的共同成熟才算完全成熟［２］；因為只有形態學上的成熟還不能保證胚性細胞具有胚胎發生的能力，只有形態上和生理上均達到成熟的體細胞胚才有利于后期的萌發和植株轉化。這一階段會有大量的生化產物積累，可為體細胞胚發生提供營養保障；在胚胎發生早期就有淀粉的積累，隨著胚胎的發育，淀粉的含量也不斷增加，到了子葉胚階段，淀粉的積累才逐漸降低［３］；蛋白質及脂類的積累則伴隨體細胞胚的發生從基部到底部呈梯度變化［４］。

體細胞胚萌發通常僅指體細胞胚根的伸長，但胚根伸長之后并不一定伴隨莖的伸長。因此，體細胞胚萌發成功不能代表植株再生成功［２］。

植株轉化是指具有功能的根和莖的生長，植株成熟后與母體分離，產生后期可成活的小植株。成熟的體細胞胚在無植物激素、低蔗糖濃度的培養基中萌發和轉化成小植株，當植株達到一定的高度，可以進行溫室馴化和大田移栽［２］。

２影響花卉體細胞胚發生的因素

影響花卉體細胞胚發生的因素有很多，主要包括兩個方面的因素，內部因素和外部因素。內部因素主要指植物種類、外植體取材部位、細胞滲透壓等；外部因素主要是培養基以及附加的植物激素等成分和培養條件，如光照、溫度、培養方式等［５］。

２．１滲透壓調節對花卉體細胞胚發生的影響

低滲透壓是合子胚發生的一個重要的內環境因素，胚乳不僅為胚的發生提供營養物質，同時創造了一個低滲透壓的環境，以促進胚的發育。早期胚胎發生研究中使用蔗糖、甘露醇作為質壁分離劑來降低細胞的滲透壓，但近年來的研究發現，二者不僅可以穿過質膜被細胞吸收，恢復細胞滲透壓；同時高濃度的蔗糖和甘露醇對細胞也有一定的毒害作用［６］。ＰＥＧ ４０００作為一種不易透過質膜的大分子物質在花卉體細胞胚的研究中被廣泛當作周圍質壁分離劑使用，它不僅可以降低細胞的滲透壓，同時能夠促進膠凝劑的積累［７］。ＡＢＡ是在合子胚干燥和休眠的過程中主要的調控激素，胚性細胞雖然沒有經歷干燥、休眠過程，但卻能合成和積累ＡＢＡ，并且在胡蘿卜體細胞胚發育中，胚性細胞比非胚性細胞有更高的ＡＢＡ含量［８］，ＡＢＡ與ＰＥＧ組合使用可以更好地促進體細胞胚的發生。胚性細胞經過低滲處理后，還要經過適當的干燥處理才能發育成小植株，因為在合子胚發育的后期，失去水分是萌發的關鍵步驟［９］。研究發現，對云杉（Ｐｉｃｅａ ａｓｐｅｒａｔａ Ｍａｓｔ．）胚性細胞進行部分干燥處理，可以提高胚性細胞的發育程度，減少分化時間，同時還能增加胚性細胞向兩極分化的能力［１０］。

２．２植物激素對花卉體細胞胚發生的影響

植物激素在植物體細胞胚發生中起著重要的作用。５７．７％的雙子葉植物以及所有的單子葉植物在其體細胞胚發生的誘導階段都使用２，４－Ｄ，并且單子葉植物要求２，４－Ｄ的濃度較高，在０．５～５．０ ｍｇ／Ｌ，通常使用２．０ ｍｇ／Ｌ；而雙子葉植物的濃度相對較低，為０．０２～ｌ．００ ｍｇ／Ｌ，通常使用０．１０ ｍｇ／Ｌ。一般而言，植物激素誘導體細胞胚發生的胚活性大小為２，４－Ｄ＞ＮＡＡ＞ＩＢＡ＞ＩＡＡ［１１］。在研究植物愈傷組織合成生物堿的過程中，發現光照可以促進長春花［Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ （Ｌ．） Ｄｏｎ］生物堿的生物合成，同時刺激質體的形成及過氧化物酶活性，然而２，４－Ｄ抑制所有吲哚生物堿及過氧化物酶的活性［１２］。另有研究表明，胚性愈傷組織中抗氧化酶的活性較高，說明胚性愈傷組織的適應性、抗逆性強于非胚性愈傷組織，能夠為胚性細胞的分化創造有利條件［１３］，因此在體細胞胚發生后期，適當降低２，４－Ｄ的濃度是必要的。ＴＤＺ是一種人工合成的苯基脲類化合物，最開始被用作棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐｐ．）的脫葉劑［１４］。ＴＤＺ在體細胞胚培養中能夠增強組織中催化細胞分裂素向細胞分裂素核苷轉變的酶活性，也可以抑制細胞分裂素氧化酶對內源玉米素類物質的分解作用［１５］，說明ＴＤＺ有很強的細胞分裂作用，而且ＴＤＺ具有ＩＡＡ 和６－ＢＡ的雙重作用功能。ＴＤＺ在體細胞胚發生的過程中，可以有兩種方式發生作用，在間接體細胞胚發生過程中，通常在愈傷組織誘導階段加入ＴＤＺ；在直接體細胞胚發生過程中，通常在體細胞胚誘導階段加入ＴＤＺ［１６］。ＴＤＺ對不同植物體細胞胚發生的影響是不同的，對某些花卉具有高效的體細胞胚誘導作用，如譚鵬鵬［１１］在蝴蝶蘭［Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍａｂｉｌｉｓ（Ｌ．） Ｂｌ．］的體細胞胚誘導中，僅加入ＴＤＺ一種化合物就能使體細胞胚的誘導率達到６８．３％；而有的花卉則需要ＴＤＺ與其他激素配合使用才能提高體細胞胚的誘導率。

不同花卉所需激素的配比不同，不同時期所使用激素的濃度也不相同，雖然對體細胞胚發生中內源激素的報道有很多，但不同的花卉在進行體細胞胚誘導的過程中對激素的濃度配比仍然需要進行重新的摸索。如長壽花（Kalanchoe blossfeldiana Poell.）用葉片做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為ＮＡＡ １．０ ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ １．０ ｍｇ／Ｌ；白鶴芋［Ｓｐａｔｈｉｐｈｙｌｌｕｍ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄｕｍ （Ｌｉｎｄ．ｅｔ．Ａｎｄｒｅ） Ｎ．Ｅ．Ｂｒ．］用雄蕊花絲做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為ＴＤＺ ０．０５ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ １．５0 ｍｇ／Ｌ或６－ＢＡ ２．０ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ；龍牙百合（Ｌｉｌｉｕｍ ｂｒｏｗｎｉｉ ｖａｒ． ｖｉｒｉｄｕｌｕｍ Ｂａｋｅｒ）用鱗片做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為６－ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ ２．０ ｍｇ／Ｌ；地被菊（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ Ｒａｍａｔ．）用葉片做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為ＩＢＡ １．５ ｍｇ／Ｌ ＋ ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ或ＫＴ ２．０ ｍｇ／Ｌ ＋ ２，４－Ｄ ２．０ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ；鐵線蓮（Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｆｌｏｒｉｄａ Ｔｈｕｎｂ．）用莖尖做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為ＴＤＺ ０．８ ｍｇ／Ｌ ＋ ＮＡＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ；多花薔薇（Ｒｏｓａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ Ｔｈｕｎｂ．）用假珠芽做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為ＴＤＺ ２．０ ｍｇ／Ｌ ＋ ＧＡ３ ０．１ ｍｇ／Ｌ；紫斑牡丹［Ｐａｅｏｎｉａ ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ ｖａｒ． ｐａｐａｖｅｒａｃｅａ（Ａｎｄｒ．）Ｋｅｒｎｅｒ］用種胚做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為ＢＰＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ＋ＣＨ ６００.0 ｍｇ／Ｌ＋硝酸銀１０.0 ｍｇ／Ｌ；唐菖蒲（Ｇｌａｄｉｏｌｕｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓ Ｈｏｒｔ）用球莖芽做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為２，４－Ｄ １．０ ｍｇ／Ｌ ＋ ＴＤＺ ０．２ ｍｇ／Ｌ；蝴蝶蘭用莖段做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為ＴＤＺ １．５ ｍｇ／Ｌ；梅花［Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ（Ｓｉｅｂ．）Ｓｉｅｂ．ｅｔ Ｚｕｃｃ．］用子葉做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為ＮＡＡ １．０ ｍｇ／Ｌ ＋ ＩＢＡ １．０ ｍｇ／Ｌ；一品紅（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ Ｗｉｌｌｄ）用苞片做外植體進行體細胞胚培養時，激素配比為２，４－Ｄ １．０ ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ。從這些研究中不難看出，２，４－Ｄ和ＴＤＺ是花卉體細胞胚研究中使用較多的兩種激素（表１）。

３花卉體細胞胚發生的應用前景

３．１花卉體細胞胚發生在胚產量及遺傳穩定性方面的應用

傳統的器官發生，要經過脫分化過程，并且很多花卉在脫分化后的愈傷組織不能正常再分化，而體細胞胚的發生與合子胚發生具有相類似的過程，通過與合子胚發生相似的途徑（經過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉期胚階段）形成胚狀體，從而發育成完整的植株［２７］，這就保證了遺傳的穩定性，同時體細胞胚的直接發生比間接發生需要的時間短，細胞發生無性系變異的可能性較小，遺傳會更加穩定。研究發現單個外植體上可以產生多個體細胞胚，如多花薔薇平均每個外植體可以產生６．５個體細胞胚［２３］，在梅花［２５］，牡丹［１］及多花薔薇［23］研究中都有次級體細胞胚的出現，這不僅增加了體細胞胚的數量，同時能為種質資源保存提供有利的條件。

３．２花卉體細胞胚在轉基因育種方面的應用

近年來，通過分子技術育種方式改良花卉品質出現了很多新的方法，其對花卉的花色、花期、花型等的改良起到了積極的促進作用。目前國內研究轉基因花卉多以器官發生水平來建立再生體系；而國外以體細胞胚為受體的轉基因技術已經較為成熟，并走向了市場，產生了顯著的經濟效益。以體細胞胚為受體可以發揮其單細胞起源、高產、遺傳穩定等的優勢，能夠滿足轉基因花卉的大規模開發及商業化生產，具有廣闊的發展前景。

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