MLPA快速產(chǎn)前診斷染色體病需綜合分析以緩解孕婦焦慮情緒

【摘要】 目的：分析MLPA技術(shù)在產(chǎn)前快速檢測常見染色體非整倍體疾病中的診斷價值和對于染色體部分片段拷貝數(shù)變異的診斷價值。材料和方法：采用319例羊水標(biāo)本分別進(jìn)行MLPA-P095試劑盒檢測21、13、18、X和Y染色體的數(shù)目并與細(xì)胞培養(yǎng)核型分析金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比。選取其中7例存在染色體部分片段拷貝數(shù)變異的標(biāo)本，提取其父母的外周血DNA行MLPA分析，將羊水標(biāo)本與父母的MLPA檢測結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果：4例染色體非整倍體疾病患兒采用MLPA均能明確檢出，2例母血污染的標(biāo)本被誤診為47，XXY綜合征。7例存在染色體部分片段缺失/重復(fù)的羊水與父母比對后至少與其中一人一致，而父母均不存在臨床癥狀，經(jīng)解釋后患者焦慮情緒有效緩解。結(jié)論：MLPA技術(shù)可以用于產(chǎn)前快速診斷常見染色體非整倍體綜合征，但部分片段未根據(jù)中國人群多態(tài)性進(jìn)行優(yōu)化，不能據(jù)此判斷是否存在染色體部分片段缺失/重復(fù)綜合征。

【關(guān)鍵詞】 MLPA;產(chǎn)前診斷;非整倍體綜合征

Rapid prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidy to calm the pregnant women

Zhang Jun1，Lu Bingwen1，Lin Junwei1，Teng Benqi1*

Address:Department of Obstetrics， The third affiliated hospital of the Sun Yat-sen University， Guangdong Guangzhou， 510630

Correspondent Author:Teng Benqi，Department of Obstetrics，The third affiliated hospital of the Sun Yat-sen University，Guangdong Guangzhou，510630，Tel:020-85252625，E-mail:16879288@QQ.comFunds:Guangdong Medical Science Funds B2009076

【Abstract】 Objective: To analyze the diagnostic value of MLPA technique in prenatal detecting of chromosomal aneuploidy and partial deletion and duplications. Methods: 319 amniotic fluid samples were analyzed with MLPA 095 kit for 21， 13， 18， X and Y chromosomes. 7 AF cases of partial dup/del were compared with their parents. Results: 4 cases of aneuploidy were correctly detected with MLPA. 2 cases of maternal blood contaminating samples were misdiagnosed with 47， XXY. Seven cases of partial del/dup were the same with at least one of their parents. Conclusion: MLPA is fitted for rapid prenatal diagnosis of aneuploidy， while partial dul/del syndromes can not be diagnosed with only this method.

【Key Word】 MLPA; Prenatal Diagnosis; Aneuploidy

【中圖分類號】 R714【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 B【文章編號】 1007-8231（2011） 07-0391-02

染色體非整倍體是指染色體數(shù)目異常，包括染色體整條或者部分片段的缺失或者重復(fù)。傳統(tǒng)的羊水培養(yǎng)核型分析的染色體產(chǎn)前診斷技術(shù)存在檢測時間過長(一般需2-3周)，工作強(qiáng)度大，技術(shù)要求高等不足之處，無法為高危孕婦提供快速的檢測結(jié)果，不易于緩解孕婦緊張焦慮的不良情緒，有可能導(dǎo)致流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局[1，2]。近年來發(fā)展起來的產(chǎn)前診斷分子技術(shù)包括熒光原位雜交(FISH)、短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分析、熒光定量PCR以及多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)等，能夠快速給予孕婦準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，有效地彌補了核型分析技術(shù)的不足。其中MLPA技術(shù)因其高通量、高分辨率、低成本等優(yōu)點在快速產(chǎn)前診斷中顯示出了較為突出的應(yīng)用潛力。同時該技術(shù)由于采用長度約40-50個堿基的DNA片段作為探針，因此能夠區(qū)分出染色體微小片段的拷貝數(shù)變異現(xiàn)象。由于缺乏相應(yīng)的確診依據(jù)，給臨床醫(yī)生解釋胎兒預(yù)后帶來困難，也給孕婦及家人帶來更多不必要的心理負(fù)擔(dān)[2]。本研究對MLPA技術(shù)在羊水產(chǎn)前快速針對染色體非整倍體疾病及染色體小片段缺失（或重復(fù)）的檢測能力進(jìn)行了分析。

1對象與方法

1.1研究對象:標(biāo)本來自于2009年5月至2010年12月期間來我院行羊膜腔穿刺術(shù)產(chǎn)前診斷的孕婦共319例，孕周為17～24周時。在超聲引導(dǎo)下抽取羊水，其中5ml用于MLPA檢測，20ml用于染色體培養(yǎng)。其中7例羊水MLPA結(jié)果存在單個峰值異常，經(jīng)知情同意后抽取孕婦本人及丈夫的外周血標(biāo)本2ml用于MLPA分析。

1.2.1標(biāo)本處理:取羊水標(biāo)本置于1.5ml的離心管中13000rpm離心10min，去上清至剩余50～100μl，然后采用Qiamp DNA mini kit(Qiagen，德國)按照說明書的要求提取DNA并置于-20℃冰箱中儲存，外周血DNA提取亦采用上述試劑盒進(jìn)行。

1.2.2MLPA反應(yīng):選取P095-A2Aneuploidy試劑盒（MRC，荷蘭）按照說明書要求進(jìn)行操作，大致方法如下：選取DNA50ng，98℃變性5min后加入1.5μl的SALSA探針混合液和1.5μl的MLPA緩沖液，混勻后95℃孵育1min，然后60℃過夜(16～18h)。將雜交產(chǎn)物在54℃下加入現(xiàn)配的連接酶混合液32μl，混勻后，54℃孵育15min，接著98℃加熱5min滅火連接酶；取連接產(chǎn)物10μl加入4μl的SALSAPCR緩沖液、10μl的多聚酶混合液、26μl去離子水后混勻，進(jìn)行PCR反應(yīng)（ABI9700，美國），PCR反應(yīng)條件為:95℃30s;60℃30s;72℃1min，35個循環(huán)，72℃再孵育20min。取1μlPCR產(chǎn)物與9μl的甲酰胺（ABI，美國）、0.1μl的GS500(LIZ)混合后95℃熱變性5min，立即放入冰盒中至少2min，然后采用3100DNA測序儀（ABI美國）進(jìn)行毛細(xì)管電泳儀并分析。

1.2.3MLPA數(shù)據(jù)分析:采用Genemarker1.85軟件（Softgenetics，美國）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以正常人作為對照，擴(kuò)增后探針信號強(qiáng)度與正常人信號相比比率大于1.3判定為重復(fù)，小于0.7判定為缺失。同一染色體所有位點同時出現(xiàn)數(shù)目異常認(rèn)定為染色體非整倍體。

1.3羊水染色體培養(yǎng)按常規(guī)步驟進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1羊水MLPA-P095檢測結(jié)果與羊水細(xì)胞培養(yǎng)核型分析結(jié)果比較如表1所示。4例羊水培養(yǎng)核型分析異常的病例包括3例21三體綜合征和1例47，XXX綜合征，采用MLPA方法均得到了準(zhǔn)確的診斷。2例混有較明顯母血污染的標(biāo)本MLPA檢測結(jié)果為47，XXY，但核型分析結(jié)果為46，XY。若排除母血污染的標(biāo)本，MLPA和細(xì)胞培養(yǎng)核型分析的符合率達(dá)到100%。

表1MLPA與核型分析結(jié)果比較

2.2MLPA-P095檢測結(jié)果為單獨峰值異常的標(biāo)本中選擇7例進(jìn)行了父母雙方的外周血MLPA-P095檢測，并將結(jié)果與羊水MLPA結(jié)果比較。結(jié)果如表2所示：13、18、21、X染色體上均出現(xiàn)單獨發(fā)生片段拷貝數(shù)變異的位點。同時與父母做對比的結(jié)果顯示在父母雙方中至少有一方與胎兒的MLPA檢測結(jié)果相一致。由于父母雙方均未表現(xiàn)出臨床癥狀，因此估計上述位點異常不導(dǎo)致微缺失或微重復(fù)綜合征。經(jīng)解釋說明后孕婦表示理解，緊張和焦慮得到有效緩解。

3討論

MLPA技術(shù)因其快速、低成本、高通量等優(yōu)點在檢測基因組拷貝數(shù)變化中顯示出了良好的應(yīng)用價值。其原理是針對染色體上的特定序列設(shè)計若干對探針， 每對探針的末端為共有的一段序列。當(dāng)兩條探針與目標(biāo)基因完全配對雜交后， 再通過連接酶將其連接， 從而形成一條可供擴(kuò)增的完整雜交探針，然后通過一對和共有序列一致的通用引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，并通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離和定量。這樣就可以將片段之間拷貝數(shù)的不同轉(zhuǎn)化為毛細(xì)管電泳峰面積的不同和進(jìn)行半定量分析[3]。我們用 MLPA技術(shù)檢測對300余例羊水標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示假如剔除羊水混血等標(biāo)本，MLPA技術(shù)與常規(guī)染色體培養(yǎng)核型分析對于普通的非整倍體診斷符合率達(dá)到100%。而MLPA相比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法所需時間從2-3周顯著縮短到2至3天，可以有效緩解唐篩高危孕婦的緊張焦慮情緒。

MLPA作為快速檢測染色體非整倍體情況的技術(shù)手段具有快速、便捷、準(zhǔn)確等特點，因此在國外得到較為廣泛的應(yīng)用。但是由于檢測探針僅為40-50個堿基的長度，如果該片段發(fā)生缺失、重復(fù)或者突變，均有可能導(dǎo)致雜交結(jié)果的異常，最終影響對結(jié)果的分析[4]。因此在P095試劑盒中每條染色體分別提供了多個探針以便綜合分析。本研究發(fā)現(xiàn)多個P095檢測出現(xiàn)單獨某個峰值出現(xiàn)偏高或偏低的羊水標(biāo)本，但是僅憑此判斷存在染色體的部分缺失或重復(fù)存在風(fēng)險。經(jīng)過對羊水標(biāo)本和親代外周血標(biāo)本進(jìn)行MLPA結(jié)果比較，在7例病例中都能夠發(fā)現(xiàn)相同的位點的峰值變化?？紤]其染色體即使存在部分重復(fù)或部分缺失亦可能為人群特有的多態(tài)性現(xiàn)象，并不會致病。本研究中發(fā)現(xiàn)的可能存在結(jié)果誤讀的探針片段涉及13、18、21、X染色體的多個片段，分析其原因可能是國外試劑盒在研發(fā)中采用的人群多態(tài)性數(shù)據(jù)庫或者篩查的樣本多集中在白種人，并沒有對足夠的黃色人種進(jìn)行測試[5]。同時本研究也發(fā)現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的檢測結(jié)果為染色體部分?jǐn)?shù)目異常的樣本通常僅存在單獨位點的數(shù)量異常，如果綜合所有位點進(jìn)行分析，并不會影響判斷，但是對于染色體部分缺失或重復(fù)則有可能存在誤讀，需要進(jìn)一步采取其他方法進(jìn)行驗證。

總之，MLPA技術(shù)可以用于染色體非整倍體異常的快速產(chǎn)前診斷，但是由于人群多態(tài)性的關(guān)系，還需要對部分探針針對中國人群進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化和調(diào)整，否則可能在染色體部分缺失或重復(fù)的情況下出現(xiàn)誤判。如出現(xiàn)單位點異常，有必要對胎兒親代行MLPA分析。

參考文獻(xiàn)

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[3]Detection of chromosome aneuploidies in chorionic villus samples by multiplex ligation-dependent probe amplification.Kooper AJ，F(xiàn)aas BH，F(xiàn)euth T，et al.J Mol Diagn.2009 Jan;11(1):17-24

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[5]Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) as a stand-alone test for rapid aneuploidy detection in amniotic fluid cells.Kooper AJ，F(xiàn)aas BH，Kater-Baats E，et al.Prenat Diagn.2008 Nov;28(11):1004-10.

通訊作者

滕奔琦，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)科。

基金項目

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)基金B(yǎng)2009076。