人原發性結直腸惡性淋巴瘤裸小鼠原位移植高轉移模型的建立

【摘要】 目的:建立人結直腸惡性淋巴瘤裸小鼠原位移植高轉移模型，探討其生物學特性。方法:采用人原發性結直腸惡性淋巴瘤術中原發灶和肝轉移灶新鮮瘤組織塊植入裸鼠結直腸粘膜層內，觀察原位移植成瘤率，移植瘤的侵襲和轉移率，進行形態學（光鏡、電鏡、免疫組織化學），染色體核型，流式細胞分析。結果:依據新的WHO惡性淋巴瘤的分類法，從4例結直腸淋巴瘤標本中篩選出一株人結腸（非霍奇金B細胞）惡性淋巴瘤裸鼠原位移植肝轉移模型HCBL-0301和一株人直腸（非霍奇金B細胞）惡性淋巴瘤裸鼠原位移植高轉移模型HRBL-0302。移植瘤組織病理學均為非霍奇金（大B細胞性）高度惡性淋巴瘤，免疫組織化學示CD19、CD20、CD22、CD45陽性，CD3、CD7陰性。染色體眾數范圍55條～69條；流式細胞示DI值1.59～1.71，均為異倍體。HCBL-0301和HRBL-0302分別傳至31代和27代，共移植裸鼠326只；自第3代起腫瘤的移植生長率和液氮凍存復蘇成活率均為100%，HCBL-0301多轉移肝右葉，轉移率為100%；淋巴結轉移率和腹腔種植轉移率為67.4%。HRBL-0302多轉移左右肝葉，轉移率為63.7%，淋巴結轉移及腹腔種植轉移率56.4%。人結直腸惡性淋巴瘤在裸鼠結直腸內自主侵襲性生長。發生血液轉移、淋巴轉移和腹腔內種植性轉移。結論:HCBL-0301和HRBL-0302是首次建立成功的人結直腸惡性淋巴瘤裸鼠原位移植均出現自發性高轉移模型?？捎糜诮Y直腸惡性淋巴瘤的發病機理、侵襲和轉移及實驗治療的研究。

【關鍵詞】 結腸腫瘤；直腸腫瘤；淋巴瘤；腫瘤移植；腫瘤轉移；疾病模型

【中圖分類號】 R735【文獻標識碼】 Ｂ【文章編號】 1007-8231（2011） 07-0297-03

原發性結直腸惡性淋巴瘤臨床罕見，占所有原發性結直腸惡性腫瘤的1.2%[1]。病因學和發病機制迄今尚未闡明[2]，手術是原發性結直腸淋巴瘤的主要治療手段。但是，術后復發和轉移是其主要死亡原因[3]。與大腸其他腫瘤相比基礎和臨床研究的深度和廣度仍很受限[4]，缺少可供直接研究的腫瘤組織標本和實驗研究的動物模型，建立高轉移腫瘤動物模型是研究腫瘤轉移生物學行為的前提，使人體外整體實驗研究人類惡性腫瘤的自發轉移成為可能。這也是在人體外研究進行性腫瘤的實驗治療的關鍵。為深入探討結直腸惡性淋巴瘤的生物學行為，我們采用組織學完整的人結直腸惡性淋巴瘤新鮮組織塊原位移植裸鼠，首次成功地建立起一株人原發性結腸惡性淋巴瘤裸鼠原位移植肝轉移模型和一株人原發性直腸惡性淋巴瘤裸鼠原位移植高轉移模型，分別命名為HCBL-0301和HRBL-0302。這兩株模型完整地重現了人結直腸惡性淋巴瘤的自然臨床病理過程，且轉移模式與臨床病人相似。為結直腸惡性淋巴瘤的基礎和臨床研究提供了理想的動物模型平臺。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：BALB/C—nu/nu裸小鼠由中國醫學科學院腫瘤研究所腫瘤醫院動物室提供。鼠齡3～5周，體重17～20克，雌雄兼用，在SPF（specific-pathogen free）條件下的本院裸鼠室內飼養。

1.1.2標本來源：4例經病理診斷為原發性結直腸惡性淋巴瘤，術中新鮮瘤組織標本由解放軍第202醫院和遼寧省腫瘤醫院提供。

1.2方法

1.2.1標本處理：無菌切取的人結直腸惡性淋巴瘤活體瘤組織置入RPMI-1640培養液中，消除非瘤組織，剪切成1mm3組織小塊，供移植用。

1.2.2原位移植與傳代[5]：裸鼠在0.5%戊巴比妥鈉（30mg/kg）靜脈注射全麻下，取腹正中線切口，辨認結直腸，在結直腸的漿膜面向腸壁內做3mm切口深達黏膜層，以0/10無損傷縫合線，經切口將2粒1mm3瘤小塊固定于腸壁黏膜層，0/7絲線縫合腹膜，0/5絲線縫皮。術后繼續飼養，觀察期為60-90天，當荷瘤裸鼠處于瀕死狀態時，取其中1只荷瘤裸鼠用頸椎脫位術處死，系統解剖，取出移植瘤。一部分瘤組織以原代移植方法行鼠間連續傳代，每次傳代5～10只不等；另一部分瘤組織液氮凍存備用，進行相關指標檢測，其他動物以觀察其腫瘤的生長、侵襲和轉移。

1.2.3解剖學和組織學檢查全部荷瘤裸鼠均經詳細解剖學檢查，測量腫瘤體積觀察侵襲周圍臟器情況；觀察結腸上、旁、中間和終末淋巴結、直腸上動脈、腸系膜下動脈、腹主動脈周圍淋巴結、肝和脾等各內臟有無腫瘤的轉移。移植瘤組織，區域淋巴結和各臟器經10%中性福爾馬林固定，石蠟切片，H.E染色，光鏡觀察。把整個肝臟切開全部包埋于石蠟，于不同平面切片10-20張，并觀察肝轉移情況。

1.2.4免疫組織化學染色采用LSAB法，對全部裸鼠結直腸腫瘤或有器官轉移的切片應用CD3、CD7、CD19、CD20、CD22、CD45抗體進行染色，所用試劑均購自DaKo公司。

1.2.5電鏡觀察移植瘤組織以2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定，Epon-812包埋，超薄切片，鈾-鉛染色，PHILIPS-CM10透射電鏡觀察。

1.2.6流式細胞分析[6]采用美國FACS-420型流式細胞儀，對正常結直腸黏膜細胞、移植瘤細胞進行DNA含量測定。

1.2.7染色體檢查采用短期培養，不加有絲分裂刺激方法，收獲細胞常規制片，GTG法染色，顯微鏡下觀察[5]。

1.2.8結直腸惡性淋巴瘤組織學分類標準：采用2001年新的WHO分類方法[7]。

1.2.9統計學處理差異顯著性檢驗采用t檢驗，數據以 ±s表示，在SPSS10.0統計軟件上完成。

2結果

2.1HCBL—0301與HRBL-0302的建立

HCBL—0301模型瘤源標本取自1位59歲男性手術切除的右半結腸惡性淋巴瘤原發灶和肝轉移灶新鮮組織塊（病理診斷：原發性結腸非霍奇金B細胞高度惡性淋巴瘤，伴肝轉移），分別各移植裸鼠3只、6只裸鼠均獲首代移植成功。目前已傳至31代，共移植裸鼠193只，平均潛伏期為7.6天，傳代間期為27.4天，腫瘤的移植生長率和液氮凍存復蘇成瘤均為100%。尸解發現：結腸壁可見許多圓形或不規則形的斑塊狀浸潤病灶，直徑為0.3mm×0.5mm至0.6mm×0.9mm。粘膜皺襞消失，表面見有潰瘍形成。切面，整個腸壁增厚，腫瘤細胞主要侵襲粘膜下層，有的區域肌層和漿膜層亦被浸潤破壞?？梢娔c穿孔，腫瘤呈灰白色。經病理切片檢查：193只裸鼠結腸均見淋巴瘤細胞侵襲生長。125只結腸上、旁、中間淋巴結轉移（64.77%），肝轉移灶移植的裸鼠多伴有廣泛腹腔播散種植轉移，193只發生肝轉移（100%）可見肝轉移主瘤周圍衛星結節和全肝的播散。移植后的26天荷瘤裸鼠開始消瘦，43天明顯衰竭，腹部彭隆，因衰竭瀕臨死亡，荷瘤裸鼠最長生存期為62天。

HRBL—0302 模型瘤源標本取自1位43歲男性手術切除直腸惡性淋巴瘤原發灶新鮮組織塊，（病理診斷：原發性直腸非霍其金B細胞高度惡性淋巴瘤）移植裸鼠6只，4只獲得移植成功。首代移植成功率為66.7%。目前已傳至27代，共移植裸鼠133只。平均潛伏期為6.4天，傳代間期24.7天。從第3代起傳代腫瘤成瘤率和液氮凍存復蘇成活率均為100%。尸解發現：腫瘤彌漫侵襲直腸壁全層，整個腸壁浸潤肥厚，可見許多圓形或不規則形的斑塊狀浸潤病灶，粘膜皺襞完全消失，整個腸壁顯著增厚，切面灰白色， 均質狀。表面見數個圓形、卵圓形或不規則多發性潰瘍，大小0.7mm×0.5mm至0.4mm×0.3mm不等。邊緣隆起，底部不平，經病理切片檢查：127只裸鼠直腸均見淋巴瘤細胞彌漫侵襲生長，85只（63.7%）發生肝轉移，75只（56.4%）發生直腸旁，直腸上動脈，腸系膜和腹股溝淋巴結轉移和腹腔種植轉移。原位移植后的23天荷瘤裸鼠開始消瘦，37天明顯衰竭，腹部彭隆，因衰竭瀕臨死亡，荷瘤裸鼠最長生存期為67天。

2.2HCBL-0301和 HRBL-0302模型的侵襲和轉移

2.2.1淋巴結轉移：局限于腹腔，結腸上、旁、中間和終末淋巴結，直腸旁、上動脈、腸系膜和腹股溝淋巴結，少數動物有肝門淋巴結轉移。依受累程度，淋巴結轉移分為三期：①早期：只在輸入淋巴管和邊緣竇內出現瘤細胞團；②中期：瘤細胞進一步向副皮質和髓質內侵襲性生長；③晚期：除在邊緣部分殘存少量淋巴結組織外，整個淋巴結幾乎為瘤細胞侵占。

2.2.2肝轉移：出現在原位移植第3周末，HCBL-0301模型肝轉移，多局限在肝右葉，呈結節巨塊形，在其周圍有小瘤塊散在。HRBL-0302模型肝轉移呈彌漫型，瘤灶可散布在肝左、右葉甚至全肝，呈大小不一，數目不等圓形或橢圓形灰白色的瘤結節。瘤灶位于肝實質內。轉移灶小至血管內瘤栓；大至肉眼可見直徑為0.3mm×0.4mm和0.7mm×0.9mm。最大直徑為1.5cm×2.5cm，鏡下見轉移瘤細胞呈侵襲性生長。嚴重時肝組織由瘤結節替代。

2.2.3腹腔種植轉移見于腹腔臟層、壁層腹膜及網膜、胃壁、腸壁、腸系膜種植的灰白色瘤結節。有的裸鼠可見廣泛腹腔種植的全腹腔癌病。

2.3移植瘤的形態學特征

2.3.1HCBL-0301光鏡下瘤細胞彌漫分布，核大濃染，呈圓形、卵圓形和腎形，可見核仁，胞漿少，腸粘膜腺體被瘤細胞分隔，萎縮減少。結腸全層被無數瘤細胞浸潤。電鏡下瘤細胞核大，不規則，核圓形或橢圓形；異染色質沿核膜分布，呈條塊狀，核仁小，靠近核膜；胞質少，見少數腫脹變空線粒體及少量長的粗面內質網。

2.3.2HRBL-0302光鏡下彌漫侵襲腸壁全層及粘膜表面，細胞大，卵圓形或多角形，胞漿少，可見多核瘤巨細胞，核大，呈圓形或不規則形，核染色質不均勻，可見核仁，病理核分裂相多見。電鏡下瘤細胞核大。核多形性，有的核有1-2條不規則深溝及不對稱分葉，呈多葉核。少數核呈圓形或卵圓形，異染色質沿核膜聚集，核仁大小不一。胞質少，有少量腫脹線粒體及擴張粗面內質網。

2.4免疫組織化學檢查

HCBL-0301模型和HRBL-0302模型移植瘤細胞對CD19、CD20、CD45均呈陽性表達，對CD3、CD7 均呈陰性表達。

2.5瘤細胞DNA含量分析

HCBL-0301模型和HRBL-0302模型原位移植瘤細胞FCM檢測均示異倍體，結果見表1。

表1HCBL-0301和HRBL-0302移植瘤FCM DNA檢測結果（±s）

Table 1. DNA detection of transplanted tumors from HCBL-0301 and HRBL-0302 by flow cytometry （±s）

注：與結直腸正常細胞比較*P<0.01。

2.6染色體核型分析

HCBL-0301和HRBL-0302模型原位移植瘤的染色體數目分別為54-59條和56-69條，介于二倍體和三倍體之間，均為非整倍體。

3討論

人原發性結直腸惡性淋巴瘤裸鼠原位移植高轉移模型的建立過程，也是關于影響移植瘤轉移諸因素的分析認識過程。移植瘤轉移經歷了瘤細胞從原發瘤灶脫離，通過侵襲在周圍間質中生長，并與局部毛細血管或淋巴管內皮細胞密切接觸并穿透其管壁；或突入腔道并被轉運到靶器官，再穿透毛細血管或淋巴管壁并在基質中不斷生長，形成新的腫瘤轉移灶。實際上，癌轉移是癌基因與抑癌基因參與調節的一個多步驟、多因素的極其復雜的過程。癌的侵襲和轉移的研究，需要有相應的轉移模型。Luzzi等[8]用實驗性轉移模型研究表明，進入血液循環中的癌細胞真正能夠存活的不到0.1%，形成轉移灶者不到0.01%。說明實驗性模型轉移率極低，建立自發性轉移模型更加困難。因此，建立良好的自發性轉移模型仍然是人癌轉移模型研究領域的難題。經國際聯機檢索，縱觀國際上胃腸道惡性淋巴瘤動物模型，在以前的文獻中始終未見自發性高轉移的人胃腸惡性淋巴瘤模型的系統報告，僅我院建立的人原發性胃惡性淋巴瘤高轉移模型HGBL-0201和人小腸原發性惡性淋巴瘤高轉移模型HSIL-0102為研究胃腸惡性淋巴瘤自發轉移的基本實驗材料[5.9]。迄今為止，人結直腸惡性淋巴瘤裸鼠原位移植高轉移模型的建立均未見報道。本研究采用組織學完整的人結直腸惡性淋巴瘤新鮮組織塊原位移植及體內篩選的方法，成功地建立了國際首例能完全重現人結直腸惡性淋巴瘤臨床病理過程的HCBL-0301 和HRBL-0302動物模型，屬于人癌高轉移模型移植方法的創新，填補了國內外在這一領域里的空白。

本研究所建立的HCBL-0301和HRBL-0302模型，經過長達3年鼠間連續傳代，已分別傳至31代和27代，這種象結直腸惡性淋巴瘤病人樣的高轉移模型的移植瘤，不僅組織病理學、免疫組織化學表型，超微結構，DNA倍體水平和染色體核型的特點與人源結直腸惡性淋巴瘤細胞相一致，而且腫瘤的移植生長率和液氮凍存復蘇成活率均為100%，說明該模型系統的生物學特性是穩定的。

本研究發現HCBL-0301和 HRBL-0302模型展示的生物學行為與臨床病人有驚人的相似，如移植瘤在裸鼠結直腸廣泛侵襲性原位生長，腹部轉移，伴廣泛腹腔種植的全腹腔癌病，淋巴結轉移，肝轉移和結直腸梗阻。這些結果完整地重現了結直腸惡性淋巴瘤患者的臨床病理過程，且轉移模式與臨床病人相似。因此，人結直腸惡性淋巴瘤裸鼠原位移植模型是一種最接近人的結直腸惡性淋巴瘤轉移模型，具有重要價值。

腫瘤轉移有器官特異性，我們的實驗表明肝臟是HCBL-0301和 HRBL-0302模型轉移的特異器官。應用肝轉移灶建立的HCBL-0301模型肝轉移率之高（100%），轉移程度之重，宿主生存期之短，均說明該模型系統惡性程度高，也說明了轉移灶移植是提高轉移率建立高轉移模型的有效方法。Cowan等報道人NHL肝轉移率高達40%，而本研究326只荷瘤裸鼠HCBL-0301模型肝轉移率高（100%）高于文獻報道。HRBL-0302模型肝轉移率為63.7%與Leichman等報道的因結直腸癌轉移而死亡的患者，有45～71%存在肝轉移相似。這也是本實驗首次證實結直腸惡性淋巴瘤與結直腸癌肝轉移的發生率和轉移模式相似的報道。在這種明顯肝轉移表型的背后必定有其內在的轉移分子機制，對肝轉移灶和原發灶腫瘤細胞在體內移植進行篩選，可有助于尋找肝轉移相關基因。對研究結直腸惡性淋巴瘤肝轉移機制和篩選早期診斷肝轉移腫瘤標志物及治療靶標均具有重要意義。

綜上所述，我們首次建立成功的HCBL-0301和HRBL-0302模型，完整地重現了Ann Arbor 將人結直腸惡性淋巴瘤病變分為4期的全部臨床過程。為深入研究結直腸惡性淋巴瘤的生物學特性、組織發生、侵襲和轉移機制，實驗治療和腫瘤免疫提供了理想的實驗動物模型平臺。

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基金項目

國家重點科技攻關計劃基金資助項目（編號96A230603），遼寧省自然科學基金（編號20042153）。