落新婦甙對心臟移植排斥反應(yīng)中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)的影響

摘要目的 探討落新婦甙對心臟移植排斥反應(yīng)中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）表達(dá)的影響。方法 采用小鼠頸部心臟移植模型，隨機(jī)分為3組：對照組，移植組， 落新婦甙組。于術(shù)后第5天取移植心臟，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法觀察iNOS 的表達(dá)情況。結(jié)果移植組iNOS 表達(dá)明顯升高（與對照組相比，P<0.01）。落新婦甙組iNOS 表達(dá)明顯降低（與移植組相比，P<0.01）。結(jié)論落新婦甙對心臟移植排斥反應(yīng)的免疫抑制作用可能與其抑制iNOS 的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞心臟移植 新婦甙 斥反應(yīng) NOS

文章編號1008-5807（2011）05-096-03

心臟移植已成為終末期心臟疾病的有效治療手段，但急性移植排斥反應(yīng)仍然是影響心臟移植手術(shù)能否成功及受體長期存活的關(guān)鍵。隨著移植免疫的發(fā)展，對排斥反應(yīng)認(rèn)識的逐漸深入，目前認(rèn)為一氧化氮(nitric oxide， NO)在心臟移植排斥反應(yīng)中起重要作用。心臟移植急性排斥反應(yīng)時(shí)，移植物周圍浸潤的活化T細(xì)胞大量表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）并與急性排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。落新婦甙是一種從傳統(tǒng)中藥土茯苓中提取的黃酮類化合物，能有效抑制心臟移植排斥反應(yīng)并選擇性誘導(dǎo)移植排斥反應(yīng)中活化T細(xì)胞凋亡。落新婦甙使排斥反應(yīng)中活化T細(xì)胞凋亡時(shí)，對iNOS的表達(dá)有無影響，目前尚未見報(bào)道。本研究擬通過小鼠頸部心臟移植模型， 探討落新婦甙對心臟移植排斥反應(yīng)中iNOS表達(dá)的影響。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)動物分組與模型

健康雄性BALB/C小鼠32只和C57小鼠64只，體重20～25g，2～3月齡，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所提供。隨機(jī)分為3組:(1) 對照組: 供、受體各16只，供、受體均為C57小鼠，行頸部心臟移植，移植后每天用生理鹽水1ml 灌胃。(2)移植組: 供、受體各16只，供、受體分別為BALB/C、C57小鼠，行頸部心臟移植，移植后每天用生理鹽水1ml 灌胃。 (3)落新婦甙組: 供、受體各16只，供、受體分別為BALB/C、C57小鼠，行頸部心臟移植，移植后每天用落新婦甙5mg/kg 灌胃。小鼠的頸部心臟移植模型是筆者根據(jù)Chen術(shù)式進(jìn)行改進(jìn)與簡化，將供心主動脈與受者頸總動脈行端側(cè)連續(xù)吻合，吻合完成后，接著進(jìn)行供心主肺動脈與受者頸外靜脈行端端連續(xù)吻合。

（二）指標(biāo)檢測

于移植術(shù)后第5天處死小鼠，取移植心臟，切取左室壁組織，置于液氮中凍存，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） 法檢測iNOS mRNA水平變化。iNOS引物由上海生物工程公司合成，引物序列及擴(kuò)增片段如下：iNOS 正義鏈 5’TGCATCAATAACCTGAACCGAGCA 3’， 反義鏈 5’GCACCTTCGAATTTGCCCATTGATC 3’， 擴(kuò)增片段 638bp.€%[-Actin 正義鏈 5’GCCATCCTGCGTCTGGACCTG 3’，反義鏈 5’CATTTGCGGTGCACGATGGAG 3’，擴(kuò)增片段 815bp. 以€%[-Actin 為內(nèi)參照。 反應(yīng)完成后取PCR產(chǎn)物在2% 瓊脂糖凝膠中電泳，電泳完畢后在紫外燈下照片。圖像輸入儀攝取產(chǎn)物DNA 和內(nèi)參照DNA電泳條帶圖像，全自動圖像分析系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為灰度值，產(chǎn)物DNA 和內(nèi)參照DNA電泳條帶圖像灰度值比例即為樣品mRNA相對含量。

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以Ｐ<0.05作為判斷顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

二、結(jié)果

PCR產(chǎn)物電泳及條帶密度掃描顯示，與對照組相比，移植組iNOS mRNA表達(dá)明顯升高， (1.59€?.18 vs 0.31€?.08，P<0.01)；與移植組相比，落新婦甙組iNOSmRNA表達(dá)明顯降低 (0.33€?.04 vs1.59€?.18， P<0.01)。（圖1）。

三、討論

本研究結(jié)果顯示，心臟移植急性排斥反應(yīng)時(shí)，iNOS 的表達(dá)明顯升高，這與國內(nèi)外報(bào)道基本一致。我們的研究還發(fā)現(xiàn)落新婦甙能顯著抑制心臟移植排斥反應(yīng)中iNOS 的表達(dá)，提示落新婦甙通過降低一氧化氮的合成，預(yù)防了一氧化氮的細(xì)胞毒性作用，從而保護(hù)了移植心臟。

一氧化氮是體內(nèi)多種組織或細(xì)胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)分子，目前研究發(fā)現(xiàn)其與移植器官排斥反應(yīng)關(guān)系密切，在排斥反應(yīng)過程中， 一氧化氮的合成與釋放發(fā)生了改變，并影響著器官移植的成功。一氧化氮作為人體內(nèi)一種生物學(xué)活性分子，有兩種來源。一種是非酶生(non-enzymistigense)，來自體表或攝入的無機(jī)氮的化學(xué)降解或轉(zhuǎn)化，此來源只占極少部分；另一種是酶生(enzymistigense)，由一氧化氮合酶(NOS)所催化生成，此來源只占絕大部分。作為一氧化氮生成過程中關(guān)鍵酶的NOS以三種形式存在：內(nèi)皮型NOS（eNOS）、誘導(dǎo)型NOS（ iNOS）和神經(jīng)元型NOS（ nNOS）。正常心臟中內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞主要以eNOS形式存在，nNOS極為稀少。nNOS基因定位于第12對常染色體，主要存在于腦和神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，故又稱為腦型或神經(jīng)型(nNOS)。eNOS基因定位于第7對常染色體上，主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，故稱為內(nèi)皮型(eNOS)，兩者統(tǒng)稱為構(gòu)成型(constitutive NOS， cNOS)，其活性為鈣和鈣調(diào)蛋白依賴的，其合成的一氧化氮壽命極短(幾秒到幾分鐘)。而iNOS基因定位于第17對常染色體上，存在于各種類型的細(xì)胞中，包括巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)腦、中性粒細(xì)胞，為非鈣依賴性的，只在細(xì)胞受到刺激被激活后才表達(dá)，生成的一氧化氮能持續(xù)相對較長時(shí)間(幾小時(shí)到幾天) 。

生理情況下內(nèi)皮細(xì)胞通過eNOS短暫合成少量NO，具有重要作用：NO彌散于平滑肌細(xì)胞通過cGMP 途徑松弛血管；進(jìn)入血流抑制血小板及白細(xì)胞的活化、粘附、聚集；通過直接抑制中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)減少氧自由基的產(chǎn)生，從而對心肌起保護(hù)作用。但當(dāng)外界條件如Th1型炎性細(xì)胞因子TNF-€%Z、IFN-€%\\等刺激移植物浸潤T淋巴細(xì)胞時(shí)，緩慢持久產(chǎn)生大量的具有細(xì)胞毒性的NO，并且與氧反應(yīng)生成新的氧自由基，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死以及心室功能衰竭。

越來越多的研究表明， iNOS在器官移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，多種免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、活化的T淋巴細(xì)胞等都能表達(dá)iNOS。器官移植排斥反應(yīng)中產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1€%[(IL-1€%[)，腫瘤壞死因子€%Z(TNF-€%Z)，白細(xì)胞介素-2(IL-2)等激活T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，表達(dá)大量iNOS ，進(jìn)而催化L-精氨酸(L-Arg)生成大量的NO。其中TNF-€%Z是誘導(dǎo)iNOS 合成的重要因子， TNF-€%Z開始表達(dá)多出現(xiàn)在移植后第3天，與iNOS 在多在移植后第4天表達(dá)相一致。

最近有研究報(bào)道在器官移植后的不同時(shí)間NO的生成量和作用并不相同。NO一般在移植后第4天出現(xiàn)，在第8天開始下降。NOS表達(dá)下調(diào)原因還不清楚，可能與急性排斥反應(yīng)的晚期凝血及巨噬細(xì)胞浸潤下降有關(guān)。在移植后的較短時(shí)間內(nèi)， NO主要由eNOS合成，量較少，表達(dá)短暫，對移植物起到積極的保護(hù)作用。其機(jī)制可能包括:抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，遷移；抑制血小板、白細(xì)胞等粘附分子表達(dá)，保持內(nèi)皮完整性；通過cGMP途徑抑制血小板粘附聚集；抑制白細(xì)胞的粘附和趨化反應(yīng)，阻斷炎癥的級聯(lián)反應(yīng)；保持血管的基礎(chǔ)張力，減少痙攣，維護(hù)血管舒張狀態(tài)，這對于保持血管通暢很重要；阻止細(xì)胞因子和脂多糖所引起的細(xì)胞凋亡，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。但在移植后第4～5天，iNOS開始表達(dá)，緩慢持久生成大量的NO，此時(shí)則通過作用于巰基、金屬基團(tuán)，干擾能量代謝和DNA合成，抑制多種蛋白質(zhì)功能，使超氧化物岐化酶失活和直接損傷DNA等途徑，對移植物造成明顯的損害。

落新婦甙是一種從傳統(tǒng)中藥土茯苓中提取的黃酮類化合物，能選擇性地殺傷活化的T細(xì)胞，其途經(jīng)可能是促進(jìn)活化的T細(xì)胞凋亡。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)落新婦甙能有效抑制心臟移植排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)心臟移植排斥反應(yīng)中活化的T細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與落新婦甙上調(diào)同種反應(yīng)性T細(xì)胞Bax、Fas、FasL 和caspase-3 的表達(dá)，降低Bcl-2表達(dá)等有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)落新婦甙能顯著抑制心臟移植排斥反應(yīng)中iNOS的表達(dá)，說明落新婦甙在誘導(dǎo)心臟移植排斥反應(yīng)中活化T細(xì)胞凋亡時(shí)，還可通過抑制iNOS的表達(dá)，防止NO的大量產(chǎn)生，減少NO的細(xì)胞毒作用，從而對移植心臟起保護(hù)作用。關(guān)于落新婦甙抑制心臟移植排斥反應(yīng)中iNOS表達(dá)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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