聯合應用大鼠血管內皮細胞和胰島培養對胰島功能的影響

宋煥瑾 薛武軍 李楊 宋勇 田曉輝 丁小明 馮新順

糖尿病是嚴重危害人類健康的多發病、常見病，隨著人們生活水平的不斷提高，發病率也逐漸上升。近年來，外源性胰島素的應用，雖極大地改善了糖尿病患者的生活質量，但其不可避免的微血管病變等并發癥的發生，仍嚴重威脅著患者的生命。有報道用胰島移植術治療1型糖尿病表明，該移植術不但能糾正糖尿病患者的高血糖狀態，重建葡萄糖內穩定，且能防止和阻止各種并發癥的發生和發展，移植術后的血管再生是胰島存活和發揮正常功能的前提[1]。本實驗旨在通過將血管內皮細胞和胰島體外共培養，初步了解胰島的功能，為體內構建血管化胰島創造條件。

材料和方法

一、動物

成年Sprague-Dawley( SD )大鼠，8～10周齡，體重250～300 g，雌雄不限（ 購于西安交通大學實驗動物中心 ）。

二、胰島的分離純化

（一）10﹪戊巴比妥鈉 40 mg/kg 肌肉注射麻醉。固定四肢成仰臥位，酒精全身消毒，胸腹部備皮后常規碘酒和酒精消毒，腹部 “個”切口，分層進入腹腔，牽開腸管，顯露胰管及膽總管。

（二）1號絲線于胰管緊靠腸壁處結扎，膽總管內插入4.5號頭皮針，絲線結扎固定，切開胸腔，破心放血處死，經膽總管內插管逆行注入預冷的1.0 mg/ml 膠原酶 p 溶液 8～10ml，使胰腺膨脹，迅速摘取整個胰腺，移入預置6ml Hank液的培養皿中，剪碎。

（三）38℃水浴中輕輕震蕩消化20min，用雙硫腙（dithi-zone,DTZ）液染色進行鑒定終止消化，加入 4℃ 小牛血清10ml與4℃ Hank液30ml終止消化。振搖時用手腕的力用力振搖后呈細小顆粒（泥沙狀）。

（四）用600 μm不銹鋼絲網過濾，細胞懸液用50ml離心管,離心半徑7.5 cm,1000 r/min 4℃離心1～2min，棄上清液，沉淀物加入4℃ Hank 液洗滌，同樣方法離心洗滌，加冷 Hank 液重懸后均分到15ml離心管內，離心半徑7.5cm,1000 r/min 4℃離心2min，棄上清液。

（五）純化后的胰島計數采用 DTZ 染色法判定胰島純度。

（六）胰島細胞沉淀物加25﹪ Ficoll 4004ml混勻，其上依次分別加入23﹪、20﹪、11﹪ Ficoll溶液和Hank液各2ml，離心半徑7.5 cm，3000 r/min 4℃離心20min，吸出23﹪～20﹪及20﹪～11﹪界面的胰島，用4℃ Hank液于50ml離心管內離心洗滌2次鑒定或備用[2]。

三、血管內皮細胞的分離

取出處死后的大鼠的胸主動脈，PBS液（含有肝素）沖洗3遍，大鼠主動脈內膜暴露于外，采用1.0 g/L的Ⅱ型膠原酶對組織塊進行預消化，然后將大鼠主動脈內膜用眼科刀片刮下，在鼠尾膠原包被的培養瓶上進行培養[3-4]。

四、血管內皮細胞和胰島體外共培養

用 1000～3000 IEQ 胰島和（0.3～0.5）×106在含有 500μl RPMI 1640培養液的 1ml的凍存管中培養，1～2h后移至24孔板中繼續培養，6 h后移至15 cm2的培養皿中繼續培養2～7 d[5]，定期鑒定其活性。

五、免疫組化鑒定 ECsⅧ 因子相關抗原

六、分組：A組胰島單純培養組，B組胰島和內皮細胞共培養組，一共培養 14 d，顯微鏡下手工精心挑選 20 個直徑在 150～300 μm之間的胰島，先后加入濃度為3.3mmol/L（低糖刺激液）、16.7mmol/L（高糖刺激液）葡萄糖培養液1ml，37℃，95﹪O2，5﹪CO2培養箱孵育培養1h，分別收集上清液，-20℃凍存。上述步驟重復3次，采用放射免疫分析法測定上清液樣本中的胰島素含量，取其平均值為測定的胰島素值。

七、統計學處理

所有數據均由 SPSS 10.0 軟件處理。胰島刺激指數以表示，組間比較采取隨機分組t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、大鼠主動脈內皮細胞（rat aortic endothelial cells,RAECs）原代培養形態學

1.0 g/L Ⅱ型膠原酶消化1h的組織塊細胞，12h 可見內皮細胞貼壁，呈短梭形或類三角形，細胞呈圓形，胞質勻質，72h 后可見大量細胞，呈短梭形或類三角形，單層鋪路石狀排列，無重疊，4～5 d 可形成較純的內皮細胞集落，然后進行消化傳代，傳代后3～5 d 即可融合成單層。而其他組的組織塊未見細胞明顯游出，在培養 72h 后方可見少量細胞懸浮在培養瓶中（圖1）。

免疫組化鑒定結果：內皮細胞胞質呈棕黃色，證明其為內皮細胞（圖2）。

圖1 RAECs 原代培養形態（×40）

圖2 RAECs 相關抗原鑒定（×200）

二、胰島形態

單純培養組和共培養組DTZ染色在7 d內胰島顯示良好的形態，但是在14 d內共培養組的胰島顯示了良好的形態，而單純培養組胰島的形態不完整，逐漸松散甚至崩解。電鏡結果表明：第7天兩組胰島內部結構沒有明顯的差異，培養14 d共培養組顆粒酶明顯多于單純組，線粒體的形態以及細胞核的結構比較完整，而單純組胰島顯示了早期的凋亡、核固縮和邊集（圖3）。AO / PI染色顯示：第7天共培養組90﹪的胰島染色綠色熒光，顯示了良好的活性，而單純組大多數染色紅色熒光表明活性降低（圖4）。

圖3 不同時間培養后胰島細胞形態

圖4 共培養組胰島細胞形態（×40）

三、胰島素釋放試驗[6]

結果顯示：培養7、14 d，單純組胰島素刺激指數低于共培養組，差異具有統計學意義（P < 0.01，表 1）。

表1 不同培養天數單純組和共培養組胰島刺激指數的比較（）

表1 不同培養天數單純組和共培養組胰島刺激指數的比較（）

討 論

胰島移植術自 20 世紀 70 年代中期始引起了國內外學者的關注，但其效果仍然不夠理想，移植術成功 1 年以上的比例只有6﹪～8﹪[7-8]。近期研究發現，胰島移植物在移植術后早期（7～14 d）有近70﹪的胰島失功[9]。導致失功的原因很多，包括胰島入血后即刻發生的血液介導的炎性反應、移植術后早期供胰島血管尚未形成造成的缺血缺氧損傷以及免疫攻擊等[10-12]。近年來，移植術后胰島再血管化問題受到人們的普遍關注，認為移植術后胰島的存活在很大程度上取決于早期其血管化的程度和速度。胰島的血運十分豐富，血流占胰腺的10﹪，具有密集的毛細血管網以保證足夠的組織供氧[13]。Johansson等[5]用人動脈內皮細胞( human aortic endothelial cells,HAEC )首先對胰島細胞進行了包被實驗，在包被 2～7 d 后，胰島包被面積可達50﹪～90﹪，成功避免了血液介導的即刻炎性反應( instant blood-mediated in- flammatory reaction,IBMIR )的同時延長了移植胰島細胞存活，這些研究為減少胰島移植物早期丟失提供了新思路。

有報道稱胰島移植物功能的改善與細胞因子有密切的關系，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF），這些細胞因子刺激細胞的增殖和分化。血管內皮生長因子在細胞內和細胞外被認為是血管化最好的刺激因子之一[14-15]，通過在內皮細胞上“錨定”酪氨酸激酶受體來介導血管化的過程。而VEGF可高效特異地作用于血管內皮細胞，有強烈的促分裂和趨化作用，并可增強微血管通透性，促進血漿纖維蛋白外滲，為血管形成過程中多種細胞遷移提供一個纖維網絡[16-17]；也可以通過內皮細胞上的兩個特殊受體：fams樣酪氨酸激酸受體(fams-like tyrosine,FLT-1)和胎肝激酶1(fetal liver kinase,FLK-1)作用，直接刺激內皮細胞增殖并產生纖維蛋白溶酶原激活劑和膠原酶，促進內皮細胞移動和血管生成[18]。

本研究表明：單純培養組和共培養組DTZ染色在 7 d 內胰島顯示良好的形態，但是在 14 d 內共培養組的胰島顯示了良好的形態，而單純培養組胰島的形態不完整，逐漸松散甚至崩解。電鏡結果表明：第7天兩組胰島內部結構沒有明顯的差異，培養14 d 共培養組顆粒酶明顯多于單純組，線粒體的形態以及細胞核的結構比較完整，而單純組胰島顯示了早期的凋亡、核固縮和邊集。AO / PI 染色顯示：第7天共培養組 90﹪的胰島染色綠色熒光，顯示了良好的活性。而單純組大多數染色紅色熒光表明活性降低。胰島素刺激指數培養7、14 d單純組胰島素刺激指數低于共培養組，具有顯著性差異。說明通過內皮細胞和胰島細胞共培養能改善胰島的功能，為臨床大量開展胰島移植術增加可行性奠定了一定的基礎。

1 Menger MD,Yamauchi J,Vollmar B.Revascularization and microcirculation of freshly grafted islets of Langerhans[J].World J Surg,2001,25(4):509-515.

2 Brandhorst H,Brandhorst D,Hering BJ,et al.Significant progress in porcine islet mass isolation utilizing liberase HI for enzymatic low-temperature pancreas digestion [J].Transplantation,1999,68(3):355-361.

3 宋明寶,黃嵐,于學軍,等.隨機貼塊法培養大鼠主動脈內皮細胞及其鑒定[J].重慶醫學,2007,36(21):2177-2180.

4 林哲絢,羅文鴻,李慧.瞬間熱處理大鼠主動脈內皮細胞分離培養法[J].解剖學雜志,2004,27(5):571-573.

5 Johansson U,Elgue G,Nilsson B,et al.Composite islet-endothelial cell grafts: a novel approach to counteract innate immunity in islet transplantation[J].Transplantation,2005,5(11):2632-2639.

6 Zawalich WS,Yamazaki H,Zawalich KC,et al.Comparative effects of amino acids and glucose on insulin secretion from isolated rat or mouse islets[J].Journal of endocrinology,2004,183(2):309-319.

7 Kobayashi N，Okitsu T，Lakey JR，et al.The current situation in human pancreatic islet transplantation:problems and prospects[M].J Artif Organs,2004,7(1):1-8.

8 Matsumoto S,Okitsu T,Iwanaga Y,et al.Insulin independence after living donor distal pancreatectomy and islet allotransplantation[J].Lancet,2005,365(9471):1642-1644.

9 Fontaine MJ,Fan W.Islet cell transplantation as a cure for insulin dependent diabetes: current improvements in preserving islet cell mass and function[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2003,2(2):170-179.

10 Ozmen L,Ekdahl KN,Elgue G,et al.Inhibition of thrombin abrogates the instant blood-mediated in flammatory reaction triggered by isolated human islets: possible application of the thrombin inhibitor melagatran in clinical islet transplantation[J].Diabetes,2002,51(6):1779-1784.

11 Gainer AL,Suarez-Pinzon WL,Min WP,et al.Improved survival of biolistically transfected mouse islet allografts expressing CTLA4-Ig or soluble Fas ligand[J].Transplantation,1998,66(2):194-199.

12 Fotiadis C,Xekouki P,Papalois AE,et al.Effects of mycophenolate mofetil vs cyclosporine administration on graft survival and function after islet allotransplantation in diabetic rats[J].World J Gastroenterol,2005,11(18):2733-2738.

13 Jansson L,Carlsson PO.Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets[J].Diabetologia,2002,45(6):749-763.

14 Millauer B,Wizigmann-Voos S,Schnurch H,et al.High affinity VEGF binding and developmental expression suggest Flk-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis[J].Cell,1993,72(6):835-846.

15 Ferrara N.VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors[J].Nat Rev Cancer,2002,2(10):795-803.

16 Brown LF,Detmar M,Claffey K,et al.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a multifunctional angiogenic cytokine[J].EXS,1997,79: 233-269.

17 Shimizu H,Mitsuhashi N,Ohtsuka M,et al.Vascular endothelial growth factor and angiopoietins regulate sinusoidal regeneration and remodeling after partial hepatectomy in rats[J].World J Gastroenterol,2005,11(46):7254-7260.

18 Sugihara T,Wadhwa R,Kaul SC,et al.A novel alternatively spliced form of murine vascular endothelial growth factor,VEGF 115[J].J Biol Chem,1998,273(5):3033-3038.