骨髓間充質干細胞對移植腎缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究

卓文利 徐廷昭 吳衛真 楊順良 付云烽 陳津 譚建明

移植腎缺血再灌注損傷( ischemia-reperfusion injury，IRI )是影響移植腎早期功能的主要因素，作為一個主要的非抗原依賴性因素，可直接引起急性腎小管壞死( acute tubular necrosis,ATN )導致移植腎功能延遲恢復( delayedgraft function,DGF )，同時也可以與抗原依賴性因素協同作用，導致移植腎急性排異反應( acute rejection,AR )發生。如何減輕IRI對移植腎功能的影響是研究者一直關注的問題。骨髓間充質干細胞( mesenchyml stem cells,MSCs )是目前研究最為廣泛的成體干細胞之一，具有干細胞自我更新和多向分化潛能的共性 ，大量研究表明 MSCs 除了具有多向分化潛能外，還具有免疫調節和組織修復等功能。向受損的腎臟輸注自體或外源性MSCs，利用 MSCs 的生物學作用，促進腎臟修復，并發揮 MSCs 分化為腎小管上皮細胞的潛能，有望成為治療受損腎臟的理想手段。本研究在建立腎移植 IRI 動物模型基礎上，觀察經外周靜脈輸注 MSCs 對移植腎 IRI 的保護作用，并探討其可能作用機制。

材料與方法

一、實驗動物

4～6周齡Sprague-Dawley( SD )大鼠，SPF級，體重60～80 g，雌雄不限，5只；8～12周齡SD大鼠，SPF 級，體重250～300 g，雌性,28只。由中科院上海實驗動物中心提供。

二、實驗試劑

L-DMEM 培養基 (Gibco公司 )，胎牛血清（FBS）( HyClone公司 )，油紅 O( Sigma公司 )，NH OsteoDiff Medium 成骨誘導試劑（ Miltenyi公司），小鼠抗大鼠單抗 CD34-FITC、小鼠抗大鼠單抗 CD44-PE、小鼠抗大鼠單抗 CD90-PE（Beckman coulter公司），增殖細胞核抗原抗體（proliferative cell nuclear antigen,PCNA）（福州邁新生物技術有限公司），微量丙二醛（malondialdehyde,MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）測試盒（南京建成生物技術公司），TUNEL 原位凋亡試劑盒（德國 Boehringer 公司）。

三、大鼠骨髓 MSCs 分離及培養

根據本室常規培養方法[1]，采用密度梯度離心法結合貼壁分離法分離培養純化SD大鼠骨髓MSCs ，觀察其形態，測定細胞生長曲線，流式細胞儀檢測細胞表面標記，成骨誘導試劑盒檢測大鼠骨髓間充質干細胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）向成骨細胞分化的潛能。取第三代骨髓 MSCs 進行試驗研究用。P3代 MSCs 以0.25﹪的胰蛋白酶、0.02﹪EDTA 液消化細胞，PBS 洗3次，生理鹽水制成活細胞懸液，調細胞數1×106/ml，備用。

四、大鼠自體原位腎移植建立移植腎 IRI 動物模型及分組[2]

F18套管針穿刺左腎動脈至腹主動脈并固定，于右腎動脈上方和小腸系膜根部之間用無損傷動脈夾夾閉腹主動脈，緊靠左腎動脈下方處一起夾閉腹主動脈及下腔靜脈，右腎靜脈上方夾閉下腔靜脈，F18套管針接6 cm高0～4℃ HC-A液，剪開左腎靜脈約1 mm大小開口作為流出道，灌洗右腎至顏色蒼白，無損傷動脈夾夾閉右腎蒂，去除 F18 套管針，切除左腎，結扎左腎動靜脈殘端，松開除右腎蒂外所有血管夾，將右腎置于局部低溫保存（0～4℃）裝置內，60min后松開右腎蒂動脈夾，見腎臟顏色由紫黑變為粉紅后關閉腹腔。對照組( n=6）：尾靜脈注入1.0ml生理鹽水，下腔靜脈取血測腎功能，切取右腎，放入100ml/L（V/V )甲醛中保存并送病理檢查。假手術組( n=6）：僅尾靜脈注入1.0ml生理鹽水，切除左腎，游離右腎蒂，不作灌洗及鉗夾處理，關閉腹腔。大鼠移植腎 IRI組( n=8）：血流復灌前從尾靜脈輸注1.0ml生理鹽水。經尾靜脈輸注 MSCs 移植腎 IRI組( n=8）：血流復灌前從尾靜脈輸注1.0ml 1×106MSCs，余同大鼠移植腎 IRI組。

五、標本采集及指標檢測

于輸注 MSCs 后 24 h 后處死大鼠下腔靜脈采血 0.8～1.0ml 測定血清肌酐（serum creatinin，Scr）和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN )水平，抽取血液完畢后，迅速切取右側腎臟，切開其被膜，縱行剖開，一半以10﹪的福馬林固定并編號，石蠟包被，4 μm 厚連續切片，常規做 HE 和PAS 染色及免疫組化，光鏡下觀察。另一半置于-80℃冰箱用于SOD、GSH-Px活性及 MDA 含量測定。腎臟切片行 HE 染色、光鏡觀察進行腎臟 IRI 導致的腎小管損傷評分。采用TUNEL 法檢測腎小管上皮細胞凋亡指數( apoptosis index,AI )。檢測腎小管上皮細胞 PCNA 陽性表達情況表示增殖指數（Proliferation index,PI ）變化。檢測各組移植腎組織勻漿中 SOD、GSH-Px 活性及 MDA 含量。

腎小管損傷評分參照文獻[3]進行評分。細胞 AI 評定：細胞核被染成深棕色為染色陽性的凋亡細胞。高倍顯微鏡下（×200），皮髓質交界隨機采取5個不重復視野，計數陽性細胞數（不包括腎小球和大血管的細胞），以腎小管凋亡陽性細胞數占整個視野總腎小管細胞數的百分比的平均值作為腎小管上皮的 AI 。PI 評定：陽性反應物部位呈棕色，細胞核成淡藍色。高倍顯微鏡下（×200），皮髓質交界隨機采取5個不重復視野，計數陽性細胞數（不包括腎小球和大血管的細胞），以腎小管增殖陽性細胞數占整個視野總腎小管細胞數的百分比的平均值作為腎小管上皮的增殖指數。腎組織勻漿中SOD、GSH-Px活性及 MDA 含量測定按南京建成生物技術公司的MDA測定試劑盒、SOD測試盒、GSH-Px測試盒進行。

六、統計學處理

數據處理用 SPSS 10.0 統計軟件包進行分析，正態分布計量數據用表示，經方差齊性檢驗，再進行兩獨立樣本均數的 t 檢驗和不同時點組內的單向方差分析，檢驗水準α=0.05，P﹤0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、骨髓 MSCs 的體外分離培養

原代培養中，細胞貼壁生長是分散的克隆集落方式增殖。8～14 d相鄰集落融合成片達80﹪以上，呈漩渦狀生長，克隆間出現重疊，無接觸抑制現象發生，克隆中除了含有小的梭形和大的扁平骨髓 MSCs 外，還有一種有更強的折光性的小圓形細胞（圖1）。傳代培養的細胞于2～4 h開始貼壁，24 h 內完全貼壁并伸展生長，形態與原代細胞相似，但增殖速度明顯增快，生長5～7 d 細胞達90﹪融合，傳代后骨髓 MSCs 呈均勻分布的平均生長，小而圓的細胞隨著傳代而逐漸減少，第3代以后，細胞形態呈比較均一的成纖維狀，大部分呈長梭狀，排列規則（圖2）。利用流式細胞儀檢測培養的 P3 代骨髓 MSCs 表面標記物，結果發現CD90陽性細胞達到97.3﹪，CD34 陰性細胞為97.5﹪，CD44 陽性細胞達到99.4﹪，將2種細胞表面標記物組合發現，CD44+/CD34-細胞數約為99.1﹪（圖3）。P3代骨髓 MSCs 經成脂誘導7 d后培養細胞，細胞漿開始出現細小脂滴、細胞排列無序，培養至14 d后在相差顯微鏡低倍鏡下可觀察到細胞漿內形成高折光性脂滴，脂肪細胞主要集中在克隆中心，用油紅染色法測定可見脂肪細胞呈紅色（圖4）。在 NH OsteoDiff Medium 成骨誘導試劑誘導rBMSCs 過程中，細胞形態逐漸改變，胞漿增大，伸出多外突起，由原來的梭形變為多角形、不規則形，7 d 后細胞失去接觸抑制，呈密集重疊生長，形成密度高、輪廓模糊和透光性弱的細胞結節。10d 后鈣鈷法 ALP 染色顯示，誘導細胞呈 ALP 染色陽性，細胞內出現大量棕黑色顆粒，細胞著色程度不同。ALP 反應陰性對照組無棕黑色沉淀或結節出現（圖5）。

圖1 原代 BMSCs 顯微鏡下觀察

圖2 P3 代 BMSCs 顯微鏡下觀察

圖3 BMSCs 的流式細胞儀鑒定

圖4 BMSCs 胞成脂誘導

圖5 BMSCs 成骨誘導

二、腎功能生化指標變化（表1）

假手術組與正常對照組BUN 和Scr 值對比無統計學意義(P > 0.05），I/R組 BUN 和Scr 水平均有上升。I/R組大鼠BUN 和Scr 值于再灌注 24 h 后較正常對照組和假手術組增高( P < 0.05）。

表1 IRI 后24 h各組肌酐和尿素氮水平( )

表1 IRI 后24 h各組肌酐和尿素氮水平( )

注：與正常對照組比較，aP < 0.05; 與I / R組比較，bP < 0.05

組別 動物數（只） 尿素氮 (mmol/L) 肌酐 (μmol/L)正常對照組 6 7.1±0.6 60.3± 3.1假手術組 6 7.6±0.7 61.0± 2.0移植腎I/R組 8 36.9±4.8a 279.9± 22.6a MSC干預I/R組 8 22.6±7.8a b 223.6± 26.7a F 值 57.616 243.789 P 值 0.000 0.000

三、腎小管損傷評分

正常對照組及假手術組鏡下腎組織結構未見明顯改變。在IRI 24 h（I/R組）樣本中，腎小管上皮細胞出現核溶解和碎裂，細胞脫落以及明顯的脂肪或空泡樣變性，基底膜裸露或不完整，腎小管管腔變窄甚至堵塞，間質內明顯可見紅細胞，腎小管損傷評分為（3.17±0.65）；而在 MSCs 干預 I/R組樣本中，腎小管上皮細胞細胞核固縮、碎裂和溶解等細胞壞死和變性征象明顯減輕，腎小管輪廓尚清晰，基底膜保留較完整，腎小管管腔中未見明顯管型及堵塞，間質內僅可見少許紅細胞，腎小管損傷程度減輕，其評分為（2.21±0.75）分，與 I/R組比較差異有統計學意義（P < 0.05）（圖 6）。

四、腎小管上皮細胞AI（表2）

與正常組比較，假手術組無明顯差異，但 I/R組TUNEL 染色陽性細胞明顯增加( P < 0.05 )，典型的凋亡細胞核呈圓形、深染，有些細胞裂解成一個或數個凋亡小體。TUNEL染色陽性細胞多見于腎小管，而間質和腎小球少見。MSCs組 TUNEL 染色陽性細胞數減少，與 I/R組的差異有統計學意義( P < 0.05 )（圖7）。

圖6 各組腎組織結構病理變化（HE 染色）

五、腎小管上皮細胞PI（表3）

正常組和假手術組腎小管增殖細胞計數很低，I/R組腎小管細胞增殖活躍（P < 0.05），再灌注后經 MSCs 治療組腎小管細胞增殖計數較 I/R組增多，差異有統計學意義（ P < 0.05 ，圖8）。

表2 IRI 后24 h 各組腎組織中細胞凋亡檢測結果

表3 IRI 后24 h各組腎組織中 PCNA 表達的檢測結果

圖8 各組腎組織腎小管上皮細胞增殖情況

六、MSCs干預對各試驗組腎組織SOD、MDA、GSH-Px水平的影響（表4）

假手術組 SOD、MDA、GSH-Px 水平與正常對照組比較差異無統計學意義( P > 0.05 )，I/R組 MDA 水平上升。I/R組大鼠SOD、GSH-Px 活性均較正常對照組和假手術組降低( P < 0.05 )。MSCs 干預具有降低 MDA 水平，改善 SOD、GSH-Px 活性作用。

表4 各組腎組織 SOD、MDA、GSH-Px 水平比較()

表4 各組腎組織 SOD、MDA、GSH-Px 水平比較()

注：與正常對照組比較，aP < 0.05；與 I/R組比較，bP < 0.05

組別 動物數（只） 超氧化物歧化酶(U/mg protein)谷胱甘肽過氧化物酶(U/g protein)微量丙二醛(μmol/g protein)正常對照組 6 117.73±26.75 334.47±34.56 7.41±1.82假手術組 6 111.36±28.41 340.87±30.47 8.22±2.75移植腎I/R組 8 69.95±11.05a 247.88±32.75a 14.91±1.78a MSC 干預 I / R組 8 96.43±10.86 ab 307.92±24.56b 10.15±2.67a b F 值 8.322 13.977 15.502 P 值 0.001 0.000 0.000

討 論

IRI 是影響移植腎早期功能的主要因素，IRI作為一個主要的非抗原依賴性因素，嚴重時可以直接引起移植腎 DGF，也可以與抗原依賴性因素協同作用，導致移植腎 AR 發生。IRI 是腎臟移植術后影響移植物早期功能恢復和移植物長期存活的主要因素之一，深入認識移植腎IRI 的機制以及如何減輕 IRI 對移植腎功能的影響是研究者一直關注的問題。IRI 分為缺血階段和再灌注階段，缺血是隨著血流量下降而使腎組織缺氧缺能的狀態，再灌注則是使缺血的組織恢復血流的過程,但是再灌注的過程可以加重缺血性組織損傷。在體情況下，缺血機制主要是由于機械性或其他原因使腎血管腔變窄引起。IRI 始于能量代謝障礙及線粒體受損[4]。再灌注損傷則牽涉多方面的機制，在臨床研究中較為重要的主要有細胞內 Ca2+超載、氧自由基增加、自身炎性反應機制的激活、細胞凋亡以及無復流現象。

研究表明，活性氧( reactive oxygen species,ROS )在 IRI 中起重要作用，介導整個損傷過程。ROS 是外源性氧化劑或細胞內有氧代謝過程產生的具有很高生物活性的氧分子，如過氧化氫( H2O2)、超氧陰離子( O2-)等，在 IRI 時大量產生。ROS 可來源于線粒體電子傳遞系統、環氧化酶、脂氧化酶、內質網混合功能氧化酶和黃嘌呤氧化酶系等多條途徑。血流減少和缺氧可直接導致重要營養物質缺乏和ATP 生成減少，缺氧導致的線粒體功能障礙可使 ATP 合成進一步減少。ATP 下降即可引起內皮和上皮細胞功能障礙、細胞腫脹、游離鈣離子增加和磷脂酶活性增加。在低灌流期間，腺苷和次黃嘌呤堆積。腺苷通過其對 A1- 腺苷受體的作用能介導血管收縮，而次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成有毒性的ROS。大量產生的 ROS 若超過機體的清除能力，耗竭體內還原物質，即可直接損傷組織和誘導細胞凋亡，主要損傷機制有：（1） ROS 可直接與細胞膜不飽和脂肪酸和膽固醇發生脂質過氧化反應，使細胞膜的流動性下降、通透性增高，影響有酶參與的生化過程和離子泵功能；（2） ROS 可作用于線粒體內膜上的氧化磷酸化過程。研究發現，線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ和復合物Ⅲ是產生 ROS 的主要因素，氧化呼吸鏈的阻斷可導致細胞損傷和細胞凋亡[5]。正常狀態下，機體的精細調節會自動平衡體內產生的 ROS。如體內的SOD、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、GSH-Px和髓過氧化物酶等能迅速地清除 ROS，防止 ROS 堆積。IRI可引起機體氧化-抗氧化失調，導致自由基的脂質過氧化損傷，引起廣泛的組織結構和功能損害。

骨髓MSCs 是目前研究最為廣泛的成體干細胞之一，具有自我更新和多向分化潛能。大量研究發現骨髓MSCs 可以分化為軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞及神經細胞等。此外有研究表明骨髓MSCs 除了具有多向分化潛能外，還具有免疫調節和組織修復等功能。國內外研究表明骨髓MSCs 可促進急性腎損傷的修復，其機制可能通過骨髓MSCs 直接分化為腎小管上皮細胞，但骨髓MSCs 直接分化為腎小管上皮細胞的百分率很低[6]。近年多數學者認為骨髓MSCs 主要是通過依賴復雜調控的旁分泌機制改善和促進腎臟的內源性增殖修復，旁分泌機制促進局部損傷腎臟結構及功能恢復[7-8]。但具體機制目前尚不清楚。

腎IRI造成腎功能下降。血清BUN 和Scr 是反映腎功能變化的兩個重要指標。腎功能不全時，由于腎小球濾過率下降，腎小管的重吸收和分泌功能障礙，導致含氮的代謝終產物如BUN、Scr和尿酸等在體內蓄積，因而血中非蛋白氮的含量增加。本研究結果表明，經外周靜脈輸注骨髓 MSCs 對大鼠移植腎 IRI 引起的血中非蛋白氮的含量增加有抑制作用，改善了腎功能。我們在實驗中發現骨髓 MSCs 輸注組腎組織損傷明顯輕于缺血再灌注組，BUN 和Scr低于缺血再灌注組（P < 0.05），說明骨髓MSCs 輸注能夠減輕缺血再灌注引起的腎小管損傷，改善腎功能。骨髓MSCs 輸注組與缺血再灌注組比較，TUNEL 檢測的凋亡細胞數明顯低于后者，腎小管上皮細胞增殖指數則明顯高于后者，說明骨髓 MSCs 能夠抑制腎小管上皮細胞凋亡，促進細胞增殖，從而促進腎小管的內源性修復，包括：保護殘存的腎小管細胞，使其免于凋亡；促進殘存的腎小管細胞增殖；動員骨髓干細胞遷移入腎分化為腎小管細胞；促進腎內可能存在的干細胞增殖分化為腎小管細胞。

本研究從骨髓MSCs 對腎組織氧自由基的變化的角度探討了骨髓MSCs 對移植腎IRI的修復可能機制。研究表明造成腎IRI主要原因是腎內氧自由基增多、細胞內鈣超載、能量代謝障礙及某些激素代謝失調等。在這個復雜的病理生理過程中，活性氧對腎組織的損傷作用是腎組織病變的主要發病機制之一，甚至是許多因素損傷腎組織的最終遞質[9-10]。缺血缺氧時自由基的酶清除系統受到抑制，ATP 消耗、次黃嘌呤和黃嘌呤堆積。在再灌注開始恢復氧合血供應時，由于黃嘌呤及次黃嘌呤氧化酶催化、線粒體 “單價泄露”增加，以及中性粒細胞被補體和花生丙烯酸代謝產物激活，使氧自由基的生成量呈爆發性增加[10-11]。本研究結果顯示骨髓 MSCs在早期抑制氧自由基大量生成，使氧自由基值下降，使自由基酶清除系統得到恢復，自由基的產生與清除達到平衡，起到了間接抗氧化的作用，提示骨髓 MSCs 直接抑制氧自由基的生成可能是骨髓來源干細胞對腎損傷的保護機制之一[10]。

綜上述骨髓 MSCs 輸注能夠明顯減輕腎小管損傷和改善腎功能，其可能的機制是：MSCs通過旁分泌機制，分泌一些保護性細胞因子如 the mitogenic 和pro-survival factor insulin-like growth factor-1 (IGF-1)[12-13]等，這些因子參與調節自由基的產生與清除，改善機體氧化與抗氧化系統平衡調節能力，創造有利于腎小管上皮細胞修復的微環境，從而抑制腎小管上皮細胞的凋亡，促進腎小管上皮細胞的增殖，減輕組織的損傷程度，改善腎功能。

1 卓文利,付云烽,徐廷昭,等.大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養純化及生物學特性的鑒定[J].醫學臨床研究,2009,26(3):386-389.

2 卓文利,徐廷昭,林國章,等.大鼠移植腎缺血再灌注損傷模型的建立[J].醫學臨床研究,2009,26(8)：1365-1367.

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